1、人绒毛膜促性腺激素侧向层析检测试纸的研发 学 院：生命科学学院 专 业：生物工程 报 告 人：段海婷 1一、简介人绒毛膜促性腺激素(HCG)是孕卵着床后由人体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，它是由和二聚体的糖蛋白组成，亚基与垂体分泌的FSH（卵泡刺激素）、LH（黄体生成素）和TSH（促甲状腺激素）等基本相似，而-HCG是HCG所特有的，HCG的含量变化已成为检测是否妊娠的重要依据。市面上销售的HCG试纸被大家所熟悉，然而它只适用于一般人群，本试纸灵敏度进一步提高，也可适用于不易检测的人群。2二、检测原理 以硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细血管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，通
2、过抗原抗体结合，并利用金聚集呈现红色，检测抗原，检测结果一般有阴性和阳性。试纸条主体示意图试纸条主体示意图3试纸条阳性示意图4试纸条阴性示意图5三、实验方法与结果金的选择金标抗体的制备试纸材料的选择试纸条膜抗体的固定试纸条的组装试纸条的测试61.金的选择 金在整个检测过程中起示踪的作用，其质量的好坏直接影响试纸的检测结果。制备金一般使用的方法是用还原剂将氯金酸还原，制备金，其制备方法较多，本实验应用两种制备金的方法：柠檬酸钠法（水相）和硼氢化钠法（有机相）。7柠檬酸钠法 柠檬酸钠法制备的金在1-100纳米之间，能均一稳定的分散在液体中，由一个基础金核和外面的双离子层构成，分散溶液中的H+构成金
3、的最外层离子层，在金核表面紧连的是内层离子（AuCl2-），来维持金的悬液状态。8硼氢化钠法 以硼氢化钠做还原剂，甲苯做溶剂，通过还原氯金酸制备得到金纳米粒子。这时金颗粒表面由十二硫醇做配位保护，巯基配位结合在金颗粒表面，碳链留在外面，此时的金纳米颗粒是疏水的。两亲聚合物是既有疏水基团又有亲水基团的齿状聚合物，其通过疏水作用包裹在金纳米颗粒表面，从而使金纳米颗粒由有机相转移到水相。9柠檬酸钠法制备金的表征 水相金溶液晶莹透亮，无混浊，色泽鲜艳，呈酒红色，没有漂浮物。水相金粒径18.16nm，水相金最大吸收峰在520nm时吸收值是0.41。10硼氢化钠法制备金的表征 上图的金成黑紫色，不浑浊，没
4、有悬浮物，粒径为20.5nm，最大吸收峰在517nm时吸收值是0.19。11两种制金方法的对比结果 上图蓝色线是水相金紫外可见分光光度检测结果，粉色线是有机相相金紫外可见分光光度检测结果。两种方法制备出来的金颗粒粒径基本一致，两种方法最大的不同就是柠檬酸钠还原法制备的金的吸收值Abs在最高峰及最高峰之前一直偏大，这说明，柠檬酸钠还原法制备的金浓度大，更适合本实验后面金标抗体的制备。122.金标抗体制备 金标抗体即金和抗体大分子结合物，金在碱性条件下带负电荷，与蛋白质分子的正电荷基团借静电吸引而形成牢固结合，不会影响蛋白质活性。左边的最大吸收峰在277nm处，是没有结合的抗体蛋白；右边的最大吸收
5、峰在527nm，比原来的520nm大，说明金结合了抗体蛋白，体积变大。133.试纸材料的选择 把羊抗鼠二抗固定到A，B，C三种不同孔径的硝酸纤维素膜试纸同一位置处，将其37干燥后，在硝酸纤维素膜试纸的一端滴加金标抗体溶液，比较液体流速、是否会产生背景色，以及羊抗鼠二抗与金标抗体的结合效果。ABBBCC144.膜抗体的固定 膜的选择固定：固定蛋白用硝酸纤维素膜，因为此膜和蛋白质有很强的结合力；连接垫用玻璃纤维素膜，因为其有化学惰性，可以成为的金标物暂时载体，有利于金标抗体的释放。抗体羊抗鼠二抗金标抗体155.试纸条的组装试纸条由底板、样品垫、连接垫、NC膜（检测线和质控线）和吸水纸组成。166.
6、试纸条阳性、阴性结果测试在试纸条一端分别滴加含有和不含人绒毛膜促性腺激素抗原的溶液，待5min后样品渗移到试纸的另一端，观察结果。上图左侧是阴性结果图，右侧是阳性结果图，可以看出检测结果明显，而且两侧的三条试纸检测结果一样，体现了本试纸的重复性好，说明结果可靠，没有偶然性。17 试纸条灵敏度对比测试 将孕妇尿液稀释4倍，分别滴加于本实验的试纸和市面所卖试纸，待样品液渗移到试纸的另一端，观察结果。上图是孕妇尿液稀释4倍后检测的结果对比图，左图是本实验制备试纸，右图是市面上所卖试纸，相同的检测原液不同的检测结果。可以看出本实验制备试纸质控线和检测线都明显一样红，而市面上所卖试纸检测线和质控线颜色深浅不一样，质控线颜色深一点，检测线只能看到淡淡的红色，由此可知本实验所制试纸比市面上的试纸灵敏度高。18
