真菌毒素的检测解析课件.ppt

1、第六章第六章 真菌毒素的检测真菌毒素的检测 主要内容主要内容 1.概述概述 2.真菌毒素分类真菌毒素分类 3.真菌毒素检测基本步骤真菌毒素检测基本步骤1.概述 真菌毒素真菌毒素-由真菌生产的有毒代谢产物。具由真菌生产的有毒代谢产物。具有毒性、致癌性、致突变型和致畸性等。有毒性、致癌性、致突变型和致畸性等。“毒蘑菇、迷神麦、醉谷病毒蘑菇、迷神麦、醉谷病”真菌毒素的危害：真菌毒素的危害：（1）引起粮食作物的病害和产品腐败变质；）引起粮食作物的病害和产品腐败变质；（2）对人类和动物健康产生威胁。）对人类和动物健康产生威胁。2.真菌毒素分类真菌毒素分类 按产生菌可分为按产生菌可分为：曲霉毒素类、青霉毒

2、素类、镰刀菌毒素类等。水活度（Aw对真菌生长和产毒影响较大。真菌毒素毒性真菌毒素毒性：（1）致）致DNA损伤，有的致癌；损伤，有的致癌；（2）细胞毒性，有的破坏质膜和细胞酶的）细胞毒性，有的破坏质膜和细胞酶的作用作用 常见的真菌性食物中毒常见的真菌性食物中毒：黄曲霉毒素中毒、黄变米或灰变米中毒，赤霉沼渣粉中毒等。3.真菌毒素检测基本步骤真菌毒素检测基本步骤 1.采样和样品的准备采样和样品的准备（1）采样的地点）采样的地点 根据分析目的的不同确定采样地点，如：农田、根据分析目的的不同确定采样地点，如：农田、仓库、加工厂、运输工具、零售商和医院等。仓库、加工厂、运输工具、零售商和医院等。（2）采样

3、方法）采样方法 1）静态样品的采集）静态样品的采集 静态样品静态样品：麻袋、箱柜和车厢等容器存放分样品：麻袋、箱柜和车厢等容器存放分样品均属静态样品。均属静态样品。采样工具采样工具：顶端尖锐的长柄采样钎子。：顶端尖锐的长柄采样钎子。采样数量采样数量：小批量时采：小批量时采1/4；大批量时为整批麻；大批量时为整批麻袋数袋数 2）动态样品的采集）动态样品的采集 用商品化的十字交叉切分自动采样器用商品化的十字交叉切分自动采样器（3）采样量）采样量 采大样，按四分法对角连续多次分样缩减至采大样，按四分法对角连续多次分样缩减至12kg，最后取代，最后取代表样全部粉碎。表样全部粉碎。美国农业部美国农业部U

4、SDA的方法：成批样每批取的方法：成批样每批取3份大样，每份份大样，每份22kg。实验室分析用的样品为实验室分析用的样品为15kg。2.提取提取 1.提取溶剂提取溶剂溶剂的选择取决于待测毒素的种类、毒素性质、毒素在提取溶剂中的溶解溶剂的选择取决于待测毒素的种类、毒素性质、毒素在提取溶剂中的溶解度、提取溶剂的毒性价格、非测定成分在提取溶剂中的分配系数等。度、提取溶剂的毒性价格、非测定成分在提取溶剂中的分配系数等。选用：毒性小、极性大、价格低廉的溶剂系统选用：毒性小、极性大、价格低廉的溶剂系统常用溶剂：常用溶剂：甲醇、氯仿、丙酮、己烷、乙酸乙酯、乙睛和水中一种或多种甲醇、氯仿、丙酮、己烷、乙酸乙酯

5、、乙睛和水中一种或多种不同配比的混合物。不同配比的混合物。2.提取温度提取温度温度影响毒素的回收率，适当升高温度可以增加毒素的回收率。温度影响毒素的回收率，适当升高温度可以增加毒素的回收率。3.食品基质食品基质 固体食品：选用浸剂、洗脱、索氏回流等方法。固体食品：选用浸剂、洗脱、索氏回流等方法。液体食品：液液分配方法。液体食品：液液分配方法。提取酸性真菌毒素时，通常需提高提取溶剂系统中水相的提取酸性真菌毒素时，通常需提高提取溶剂系统中水相的pH值，使其有效地将被提取物碱化或形成水溶性碱混合物后，值，使其有效地将被提取物碱化或形成水溶性碱混合物后，再进行提取。再进行提取。3.纯化纯化 纯化：在确

6、保不损失待测毒素的前提下除去干扰杂质的过程称纯化：在确保不损失待测毒素的前提下除去干扰杂质的过程称为纯化。为纯化。常用净化方法：常用净化方法：液固萃取、液液分配、化学吸附、色谱法、透析法以及液固萃取、液液分配、化学吸附、色谱法、透析法以及SFE法等。法等。使用最广泛的是色谱法。使用最广泛的是色谱法。色谱法：色谱法：薄层色谱法（柱色谱法最常用）薄层色谱法（柱色谱法最常用）吸附色谱柱常用的吸附剂：吸附色谱柱常用的吸附剂：硅胶、矾土、氧化铝、活性炭、弗罗里硅土硅胶、矾土、氧化铝、活性炭、弗罗里硅土 分配色谱柱常用的填充剂：硅藻土、纤维素。分配色谱柱常用的填充剂：硅藻土、纤维素。固相提取（广泛采用）固

7、相提取（广泛采用）免疫亲和柱免疫亲和柱IAC（应用于农产品的新技术）（应用于农产品的新技术）4.检测检测（1）薄层色谱法）薄层色谱法（2）高效液相色谱法）高效液相色谱法（3）气相色谱法）气相色谱法（4）酶联免疫吸附试验）酶联免疫吸附试验第二节第二节 主要真菌毒素及其检验主要真菌毒素及其检验 1.黄曲霉毒素黄曲霉毒素（1）特性（2）食品中来源（3）毒性与危害（4）检测方法）检测方法 霉菌霉菌 霉菌均由分枝或不分枝的菌丝构成，许多菌丝交织在一起形成菌丝体，菌丝在光学显微镜下呈管状，210 um 比一般细菌放线菌细胞大几倍至几十倍，与酵母菌相似，而其菌丝又分为有隔菌丝有隔菌丝和无隔菌丝和无隔菌丝，再

8、就是根据其功能不同又分为营养菌丝，气生菌丝营养菌丝，气生菌丝。无隔菌丝：菌丝为长管状，单细胞，细胞质内含多个核，其生长过程只表现为菌丝的延长和细胞核的裂殖增多，以及细胞质的增加，如毛霉，根霉，犁头霉。有隔菌丝：为大多数的。菌丝由横隔膜分隔成成串的多细胞，每个细胞内含有一个或多个细胞核，有些菌丝外观看起来像多细胞，但横隔膜上有小孔，使细胞质或细胞核，可自由流通，每个细胞功能也相同，如青、曲、白地霉。营养菌丝营养菌丝（基质菌丝）就是在生长过程中，伸入到培养的基质中，为真菌提供营养的菌丝。气生菌丝气生菌丝图图（繁殖菌丝）它主要是伸入到菌周的空气环境中，它主要作用是产生孢子，产生孢子时的气生菌丝称繁殖

9、菌丝。霉菌的繁殖 主要是由繁殖器官产生孢子，繁殖器管是由繁殖菌丝产生的可以是单细胞，也可是多细胞，有时产生无性孢子，有时产生有性孢子，如青霉，曲霉，在生长过程中，由于生长条件的改变，有时产生有性孢子，有时产生无性孢子，但主要还是以无性孢子为主。有性孢子有性孢子：子囊孢子，结合孢子，卵孢子，担孢子。无性孢子无性孢子：分生孢子，关节孢子，芽生孢子，孢子襄孢子，厚膜孢子。霉菌培养特性的鉴定霉菌培养特性的鉴定 青、曲-察氏培养基，镰刀菌、芽枝霉-马铃薯葡萄糖琼脂进行划线或点种于琼脂上，2528，定期观察。生长速度生长速度：培养一定天数（5、10、15天）测大小，描述常以极慢、慢、中等、快、说明。菌的颜

10、色菌的颜色：包括子实体，气生菌丝、菌核，埋伏菌丝及其颜色。菌落表面构造菌落表面构造：蔬松，紧密、扁平、隆起，凹陷，或皱褶，有无同心环，放射沟，并观察菌全部，中心部，中间部分及边缘部分。菌落质地菌落质地：外观似毡状、绒毛状、棉絮状、羊毛状、襄状、粉粒状、明胶状或皮革状。1.1.黄曲霉毒素（黄曲霉毒素（aflatoxinaflatoxin，AFT)AFT)的特性的特性AFT目前已分离鉴定出目前已分离鉴定出20余种异构体，其中最常见的包括余种异构体，其中最常见的包括B1、B2、G1、G2、M1、M2。特性特性：紫外线下发不同颜色的荧光，蓝色荧光（紫外线下发不同颜色的荧光，蓝色荧光（Blue fluo

11、rescence）为为B族，黄绿色荧光（族，黄绿色荧光（yellow-Green fluorescence）为）为G族；族；M1和和M2为为B1、B2的羟化衍生物，主要存在于奶（的羟化衍生物，主要存在于奶（milk）及奶制品、）及奶制品、肉类（肉类（meat）中，故名）中，故名M族。族。呋喃环有双键者毒性强，具有致癌性；呋喃环有双键者毒性强，具有致癌性；溶于油、氯仿、甲醇等有机溶剂，不溶于水、乙醚、石油醚；溶于油、氯仿、甲醇等有机溶剂，不溶于水、乙醚、石油醚；耐热，加热到耐热，加热到280才裂解破坏；才裂解破坏；在中性和酸性溶液中稳定，在在中性和酸性溶液中稳定，在pH值值9-10的强碱性溶液中

12、迅速分的强碱性溶液中迅速分解。解。2.2.黄曲霉毒素的毒性黄曲霉毒素的毒性 急性毒性：急性毒性：剧毒物，毒性是氰化钾的剧毒物，毒性是氰化钾的10倍，砒霜的倍，砒霜的68倍。倍。慢性毒性：慢性毒性：动物生长迟缓，肝脏出现亚急性或慢性损伤。动物生长迟缓，肝脏出现亚急性或慢性损伤。三致作用：三致作用：致癌、致畸、致突变致癌、致畸、致突变。3.黄曲霉毒素产生的影响因素黄曲霉毒素产生的影响因素 培养基：培养基：花生、玉米等是黄曲霉的天然培养基。花生、玉米等是黄曲霉的天然培养基。温度和湿度：温度和湿度：最适生长温度在最适生长温度在37左右，产毒温度略低左右，产毒温度略低于最适生长温度，黄曲霉毒素产毒温度于

13、最适生长温度，黄曲霉毒素产毒温度28-32，相对湿，相对湿度度85以上。以上。水分：水分：产毒的适宜水分活度为产毒的适宜水分活度为0.8-0.9。pH值：值：最适最适pH值为值为3。4.卫生标准卫生标准 1995年，世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为年，世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为15g/kg。美国规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量美国规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量(指指B1+B2+G1+G2的总量的总量)不能超过不能超过15 g/kg。我国的标准我国的标准 玉米、花生、花生油、坚果和干果玉米、花生、花生油、坚果和干果(核桃、杏仁核桃、杏仁)2

14、0 g/kg。大米、其他食用油大米、其他食用油(香油、菜籽油、大豆油、葵花油、胡麻油、香油、菜籽油、大豆油、葵花油、胡麻油、茶油、麻油、玉米胚芽油、米糠油、棉籽油茶油、麻油、玉米胚芽油、米糠油、棉籽油)10 g/kg。其他粮食其他粮食(麦类、面粉、薯干麦类、面粉、薯干)、发酵食品、发酵食品(酱油、食用醋、豆豉、酱油、食用醋、豆豉、腐乳制品腐乳制品)、淀粉类制品、淀粉类制品(糕点、饼干、面包、裱花蛋糕糕点、饼干、面包、裱花蛋糕)5 g/kg。牛乳及其制品牛乳及其制品(消毒牛奶、新鲜生牛乳、全脂牛奶粉、淡炼乳、消毒牛奶、新鲜生牛乳、全脂牛奶粉、淡炼乳、甜炼乳、奶油甜炼乳、奶油)、黄油、新鲜猪组织、

15、黄油、新鲜猪组织(肝、肾、血、瘦肉肝、肾、血、瘦肉)0.5 g/kg。5.黄曲霉毒素的检测方法黄曲霉毒素的检测方法-薄层层析法薄层层析法 原理：将样品经过提取、浓缩、薄层分离后，在波长原理：将样品经过提取、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外紫外光下产生蓝紫色（光下产生蓝紫色（B1/B2）或黄绿色荧光（）或黄绿色荧光（G1/G2)提取提取 检测检测 薄层板的制备薄层板的制备 点样点样 展开与观察展开与观察 定量试验定量试验 高效液相色谱法高效液相色谱法 提取提取净化净化衍生衍生测定测定 酶联免疫吸附法酶联免疫吸附法竞争抑制法见教材竞争抑制法见教材P179 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验EL

16、ISA（enzyme linked immunosorbent assay）是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。体反应在固相表面进行。常用的酶常用的酶：辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AP）。）。ELISA方法的基本原理方法的基本原理（1）使抗原或抗体结合到固相载体表面，并保持其免）使抗原或抗体结合到固相载体表面，并保持其免疫活性。疫活性。（2）使抗原或抗体与酶结合成酶标抗原或抗体，并保）使抗原或抗体与酶结合成酶标抗原或抗体，并保持抗原

17、或抗体的免疫活性和酶的活性。持抗原或抗体的免疫活性和酶的活性。（3）酶标的抗原或抗体与相应的抗体或抗原反应后，）酶标的抗原或抗体与相应的抗体或抗原反应后，结合在免疫复合物上的酶催化底物形成水解、氧化结合在免疫复合物上的酶催化底物形成水解、氧化或还原反应，形成有色物质，其颜色的深浅与标本或还原反应，形成有色物质，其颜色的深浅与标本中的抗原或抗体中的抗原或抗体 的量直接相关。的量直接相关。ELISA方法的基本类型方法的基本类型 （一）（一）双抗体夹心法双抗体夹心法 （二）（二）间接法间接法 （三）（三）竞争法竞争法（一）双抗体夹心法（一）双抗体夹心法 洗洗涤涤洗洗涤涤洗洗涤涤待测抗原待测抗原特异性

18、抗体吸特异性抗体吸附于固相载体附于固相载体酶标抗体和底物酶标抗体和底物（二）间接法（二）间接法洗涤洗涤洗涤洗涤洗涤洗涤待测抗体待测抗体酶标抗抗体酶标抗抗体（三）竞争法（三）竞争法洗涤洗涤洗涤洗涤待测抗原待测抗原酶标抗原酶标抗原酶酶联免疫竞争法工作原理联免疫竞争法工作原理（1）酶联免疫吸附法）酶联免疫吸附法-竞争抑制法测竞争抑制法测AFB1 试剂试剂：TMB，30%H2O2，牛血清白蛋白，吐温-20 抗体抗体：抗AFB1的特异性单克隆抗体 包被抗原包被抗原：AFB1与载体蛋白的结合物 酶标二抗酶标二抗：缓冲液缓冲液：磷酸盐缓冲液、终止液1mol/L的硫酸 AFB1标准溶液标准溶液：步骤：1.提取

19、提取：10g样品样品+50ml乙腈乙腈-水水 滤纸过滤滤纸过滤 BSA洗洗液稀释液稀释 2.测定：包被抗原包被酶标微孔板测定：包被抗原包被酶标微孔板 洗液洗去多余抗原洗液洗去多余抗原 加加AFB1标准溶液标准溶液 加稀释抗体（加稀释抗体（37度度1.5h)洗液洗液洗洗3次后，加酶标二抗（次后，加酶标二抗（37度培养度培养2h）反复洗后加底物溶反复洗后加底物溶液液 加终止液加终止液（包被包被加样加样-加酶标抗原和待测抗原加酶标抗原和待测抗原-加底物显色加底物显色终止终止反应反应（显色原理（显色原理对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显

20、色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。固定固定OD值值微孔板微微 孔孔 表表 面面 情情 况况AFB1包被包被抗体抗体.（2）赭曲霉毒素）赭曲霉毒素 毒性毒性：主要对肾产生危害，造成肾肿大，当浓度超过主要对肾产生危害，造成肾肿大，当浓度超过5mg/kg时，对肝脏组织和肠道产生破坏，引起肠炎等。时，对肝脏组织和肠道

21、产生破坏，引起肠炎等。特性特性：无色结晶化合物，易溶于极性溶剂和稀的碳酸氢钠：无色结晶化合物，易溶于极性溶剂和稀的碳酸氢钠水溶液肿，微溶于水，在紫外光照射下，呈绿色荧光，该化水溶液肿，微溶于水，在紫外光照射下，呈绿色荧光，该化合物稳定，在乙醇中置冰箱避光保存一年以上而不破坏，但合物稳定，在乙醇中置冰箱避光保存一年以上而不破坏，但在谷物中随时间延长而降解。在谷物中随时间延长而降解。存在于存在于：粮谷物、大豆、葡萄及葡萄酒、咖啡、可可和巧粮谷物、大豆、葡萄及葡萄酒、咖啡、可可和巧克力、中草药、调味料、啤酒等。克力、中草药、调味料、啤酒等。检测方法检测方法：液相色谱法、薄层层析法液相色谱法、薄层层析

22、法（3）杂色曲酶毒素）杂色曲酶毒素 毒性毒性：引起肿瘤引起肿瘤 污染污染：小麦、大麦、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火小麦、大麦、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、奶酪等。腿、奶酪等。易溶于氯仿、苯、吡啶、乙睛和二甲基亚砜，微溶于甲易溶于氯仿、苯、吡啶、乙睛和二甲基亚砜，微溶于甲醇、乙醇，不溶于水和碱性溶液。在紫外线照射下，具醇、乙醇，不溶于水和碱性溶液。在紫外线照射下，具有砖红色荧光。有砖红色荧光。检测方法：薄层法，紫外分光光度计测定检测方法：薄层法，紫外分光光度计测定（4）伏马菌素）伏马菌素 自然界中最为普遍，毒性强，损伤肝肾功自然界中最为普遍，毒性强，损伤肝肾功能。能。白色粉末，易溶于水、甲醇

23、、乙睛等溶剂白色粉末，易溶于水、甲醇、乙睛等溶剂中，在甲醇溶液中不稳定，在乙睛水溶液中，在甲醇溶液中不稳定，在乙睛水溶液中非常稳定。中非常稳定。检测方法：高效液相色谱法检测方法：高效液相色谱法.（5）单端孢霉烯族化合物）单端孢霉烯族化合物 头孢菌、镰孢菌、木霉菌等。头孢菌、镰孢菌、木霉菌等。侵害玉米、小麦、大米、燕麦、大麦等。侵害玉米、小麦、大米、燕麦、大麦等。无色结晶、在常温下非常稳定，难溶于水，无色结晶、在常温下非常稳定，难溶于水，溶于极性溶剂，在烹调等加热过程中不会溶于极性溶剂，在烹调等加热过程中不会被破坏，在紫外光下不显荧光。但被破坏，在紫外光下不显荧光。但T-2毒素毒素在紫外光下产生

24、一种具有蓝色荧光物质在紫外光下产生一种具有蓝色荧光物质 检测方法：检测方法：薄层法薄层法（6）玉米赤霉烯酮）玉米赤霉烯酮 禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、木贼镰刀菌禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、木贼镰刀菌 具有类似雌激素的作用，可与雌激素受体结合而影响细胞核的具有类似雌激素的作用，可与雌激素受体结合而影响细胞核的雌激素转录，刺激含雌激素受体的乳腺癌细胞的增长。雌激素转录，刺激含雌激素受体的乳腺癌细胞的增长。特性：特性：是一种白色结晶化合物，不溶于水、二硫化碳禾四氯是一种白色结晶化合物，不溶于水、二硫化碳禾四氯化碳，微溶于石油醚（化碳，微溶于石油醚（3060），溶于碱性溶液、苯、二氯甲），溶于碱性溶液、苯、二

25、氯甲烷、乙酸乙酯、乙睛和乙醇等。耐热性强，大于烷、乙酸乙酯、乙睛和乙醇等。耐热性强，大于110度才能被度才能被破坏。破坏。易受污染易受污染：大麦、小麦、燕麦、稻谷、蚕豆、甘薯、甜菜、芝：大麦、小麦、燕麦、稻谷、蚕豆、甘薯、甜菜、芝麻等、虫害、潮湿气候贮藏不当可诱发产生。麻等、虫害、潮湿气候贮藏不当可诱发产生。分析方法：高效液相色谱法分析方法：高效液相色谱法（7）棒曲霉毒素）棒曲霉毒素 苹果青霉、巨大曲霉苹果青霉、巨大曲霉 毒性毒性：是一种免疫抑制剂，有致癌、致畸：是一种免疫抑制剂，有致癌、致畸等等 污染污染：大麦、小麦、面包、香肠、水果：大麦、小麦、面包、香肠、水果（香蕉、菠萝、葡萄等），在腐烂的苹果（香蕉、菠萝、葡萄等），在腐烂的苹果中较高。中较高。分析方法分析方法：反向高效液相色谱法：反向高效液相色谱法