经典开题报告课件.ppt

1、研究生：研究生：Tim3/Tim3L信号通路激活在信号通路激活在Hp免疫免疫致病及致病及Hp疫苗免疫防治中的作用及其疫苗免疫防治中的作用及其机制机制导导 师：师：u研究背景u研究内容、研究目标及拟解决的关键问题u研究方法、手段、技术路线及可行性分析u统计学分析u课题创新之处u年度计划及预期进展u实验条件及经费预算uHp在人群中感染率高，能引起多种严重疾在人群中感染率高，能引起多种严重疾病病u机体免疫反应在机体免疫反应在Hp感染致病和感染致病和Hp疫苗免疫苗免疫保护中均起重要作用疫保护中均起重要作用u研究研究Hp感染的免疫致病机制及感染的免疫致病机制及Hp疫苗防疫苗防治机制有重大意义治机制有重大

2、意义分泌分泌IL-2、IFN-、TNF介导细胞免疫介导细胞免疫 ThTh1Th2分泌分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13介导体液免疫反应介导体液免疫反应 Treg分泌分泌IL-10、TGF免疫抑制免疫抑制Th1Th2IFN-(-)(-)IL-4 Hp感染感染Th1占优势占优势Th1和和Th2失衡失衡招募招募Treg感染持续存在感染持续存在Hp疫苗疫苗诱导诱导Th1、Th2Th1和和Th2失衡纠正失衡纠正Treg减少减少感染清除感染清除uTim-3是第一个被发现与是第一个被发现与T细胞反应有关的细胞反应有关的Tim家族成家族成员员u表达在成熟表达在成熟Th1细胞膜上细胞膜上u不表达在未

3、成熟不表达在未成熟Th细胞、细胞、Th2细胞上细胞上u包含包含Ig-V样结构域的信号肽、粘附素样结构域、跨膜样结构域的信号肽、粘附素样结构域、跨膜区域、细胞内尾巴区域、细胞内尾巴uTim-3激活后降低激活后降低Th1反应反应uGalectin-9是是Tim-3的配体，主要表达在的配体，主要表达在CD4+的的T细胞细胞uTim-3/Galectin-9通路的激活可导致通路的激活可导致Th1细胞效应功能细胞效应功能的终止的终止u我们前期研究发现我们前期研究发现u阻断阻断Tim-3信号通路可增加信号通路可增加TLR4、MyD88表达、激活表达、激活NF-BuTLR信号的负性调控因子信号的负性调控因子

4、SIGIRR可可上调上调Tim-3的表达的表达u提示：提示：Tim-3和和TLR4信号通路可相信号通路可相互调控互调控 u我们的前期研究发现，阻断我们的前期研究发现，阻断Tim-3信号通路后，信号通路后，Treg减少减少u说明说明Tim-3信号通路在调节信号通路在调节Treg控控制炎症反应中起重要作用制炎症反应中起重要作用Tim-3/Tim-3L是新发现的调节是新发现的调节Th反应的核心环节，反应的核心环节，并且与并且与TLR4信号通路和信号通路和Treg密切相关密切相关TLR4信号通路信号通路Treg变化变化Th反应反应Tim-3/Tim-3LHp致病和疫苗免疫保护致病和疫苗免疫保护u我们的

5、研究还发现我们的研究还发现Tim-3阻断阻断u提高提高Hp疫苗的免疫保护率，但并不降低疫苗的免疫保护率，但并不降低Hp自然感自然感染小鼠胃黏膜内染小鼠胃黏膜内Hp定植密度定植密度u加剧加剧Hp疫苗接种小鼠和疫苗接种小鼠和Hp感染小鼠胃黏膜炎症程感染小鼠胃黏膜炎症程度度u提示提示Tim-3信号通路参与信号通路参与Hp感染的免疫致病和感染的免疫致病和Hp疫苗的免疫保护作用疫苗的免疫保护作用u问题：问题：Tim-3信号通路激活，将会对信号通路激活，将会对Hp感染感染和和Hp疫苗免疫产生何种影响？目前尚不清楚疫苗免疫产生何种影响？目前尚不清楚 体外研究体外研究 体内研究体内研究 n研究研究Tim-3信

6、号通路激活对信号通路激活对Hp感染和感染和Hp疫苗接种小鼠疫苗接种小鼠Th1和和Th2免疫反应、免疫反应、TLR4信号通路及信号通路及Treg的影响，以及这的影响，以及这些影响对些影响对Hp感染引起的的炎症反应和感染引起的的炎症反应和Hp疫苗免疫保护作用之间的关系疫苗免疫保护作用之间的关系 Hp感染和感染和Hp疫苗接种小鼠给予疫苗接种小鼠给予Tim-3L，观，观察以下指标：察以下指标：u 小鼠脾细胞中小鼠脾细胞中Tim-3阳性细胞数量的变化阳性细胞数量的变化u 胃黏膜局部胃黏膜局部Tim-3表达、表达、Treg和几个有代表性的和几个有代表性的Th1（IFN-、LI-12）和）和Th2（IL-4

7、、IL-10）细胞因子含量的变化细胞因子含量的变化u 胃黏膜局部胃黏膜局部TLR4信号通路的几个中间环节和下游信号通路的几个中间环节和下游分子（分子（TLR4、MyD88、NF-B）的变化。）的变化。u 胃黏膜内胃黏膜内Hp感染、炎症程度情况感染、炎症程度情况u淋巴细胞对淋巴细胞对Hp刺激的增殖反应刺激的增殖反应uTim-3阳性细胞的数量阳性细胞的数量u培养上清液中培养上清液中Th1和和Th2细胞因子含量细胞因子含量uCD4+效应效应T细胞中细胞中TLR4信号通路的几个中间环节信号通路的几个中间环节和下游分子的变化和下游分子的变化比较它们与未处理组的差异比较它们与未处理组的差异 观察小鼠的脾淋

8、巴细胞用观察小鼠的脾淋巴细胞用Tim-3L(Galectin-9)预处理后与预处理后与Hp共培养后共培养后：n阐明阐明Tim-3信号通路激活对信号通路激活对Hp感染和感染和Hp疫苗接种小鼠疫苗接种小鼠Th1和和Th2免疫反应、免疫反应、TLR4信号通路及信号通路及Treg的影响，以及这些的影响，以及这些影响对影响对Hp感染引起的的炎症反应和感染引起的的炎症反应和Hp疫疫苗免疫保护作用之间的关系苗免疫保护作用之间的关系u阐明阐明Hp感染和疫苗接种后感染和疫苗接种后Tim-3/Tim-3L信号通路的变化及与疾病和疫苗保护信号通路的变化及与疾病和疫苗保护机制的关系机制的关系u明确通过对明确通过对Ti

9、m-3/Tim-3L信号通路的信号通路的调控可否减轻调控可否减轻Hp相关性疾病的严重程度相关性疾病的严重程度和提高疫苗的免疫保护作用和提高疫苗的免疫保护作用u体内研究体内研究u未经处理组未经处理组:Hp感染组感染组Hp疫苗组疫苗组 对照组对照组uTim3配体处理组：配体处理组：Hp感染组感染组Hp疫苗组疫苗组 对照组对照组u体外研究体外研究u未经处理组：未经处理组：Hp刺激组刺激组空白组空白组uTim3配体处理组：配体处理组：Hp刺激组刺激组空白组空白组uHp标准菌株标准菌株SS1接种于含接种于含7.5%无菌绵羊血的空无菌绵羊血的空肠弯曲菌选择性培养琼脂基础上，微需氧条件肠弯曲菌选择性培养琼脂

10、基础上，微需氧条件下（下（O2 5%、CO2 10%、N2 85%）37培养培养2-3天天 uHp菌液行超声粉碎后，分别与霍乱毒素（菌液行超声粉碎后，分别与霍乱毒素（CT）和壳聚糖构建以和壳聚糖构建以CT和壳聚糖为佐剂的和壳聚糖为佐剂的Hp疫苗疫苗n6-8周龄的周龄的SPF级的级的BALB/C小鼠，给予含小鼠，给予含109/ml的的SS1 Hp菌液，菌液，0.5ml/只灌胃，隔日只灌胃，隔日1次，次，共共5次。末次灌胃次。末次灌胃4周后，取周后，取10只小鼠处死，取只小鼠处死，取胃黏膜进行病理检查和胃黏膜进行病理检查和Hp培养，确定培养，确定Hp感染感染模型的建立模型的建立 n6-8周龄的周龄

11、的SPF级的级的BALB/C小鼠，每只小鼠给小鼠，每只小鼠给予予0.5ml含含5ugCT和和1.2mg Hp抗原的抗原的PBS或或0.5ml含壳聚糖微球含壳聚糖微球-1.2mgHp抗原有效量的抗原有效量的PBS，于第，于第0、7、14、21天灌胃各免疫天灌胃各免疫1次，次，免疫后免疫后4周给予周给予109/ml的的SS1 Hp菌液，菌液，0.5ml/只只攻击小鼠，隔日攻击小鼠，隔日1次，共次，共4次。末次攻击后次。末次攻击后4周周处死小鼠，取标本检测各项指标处死小鼠，取标本检测各项指标n在小鼠在小鼠Hp接种和疫苗接种的第接种和疫苗接种的第1周周内，每天腹腔内注射内，每天腹腔内注射100g Ga

12、lectin-9 n用淋巴细胞分离液分离小鼠脾淋巴细胞，终浓用淋巴细胞分离液分离小鼠脾淋巴细胞，终浓度为度为500nM/ml的的Galectin-9预处理预处理2h，按细按细胞与细菌比例：胞与细菌比例：1:100、1:200、1:300浓度，浓度，共同孵育共同孵育24-48（3、6、12、24、48）小时）小时后，测细胞的增殖反应，并收集细胞和培养上后，测细胞的增殖反应，并收集细胞和培养上清，测各项指标清，测各项指标 u采用采用Western blot法和免疫组化法检测胃黏膜内及培养细法和免疫组化法检测胃黏膜内及培养细胞胞TLR4、MyD88、NF-B和和Tim-3u采用采用Western b

13、lot法和免疫组化法检测胃黏膜内法和免疫组化法检测胃黏膜内Tregu采用流式细胞技术检测脾细胞及培养细胞采用流式细胞技术检测脾细胞及培养细胞Tim-3阳性细胞阳性细胞 u采用采用ELISA法检测胃黏膜及培养上清内细胞因子含量法检测胃黏膜及培养上清内细胞因子含量u采用细菌培养和组织学采用细菌培养和组织学Giemsa染色法检测染色法检测Hpu采用采用MTT法进行细胞增殖试验法进行细胞增殖试验流式细胞仪检流式细胞仪检测脾内测脾内Tim3阳性细胞阳性细胞胃粘膜内胃粘膜内TLR4通路关键分子通路关键分子免疫组化、免疫组化、western blotBALB/C小鼠小鼠未处理组未处理组Tim3配体组配体组空

14、白组空白组Hp感染组感染组疫苗组疫苗组胃粘膜病胃粘膜病理及理及Hp检检测测胃粘膜内胃粘膜内Th1Th2细胞因子细胞因子ELLISA检测检测鼠脾淋巴细胞鼠脾淋巴细胞Tim3配体组配体组未处理组未处理组Hp刺激组刺激组空白组空白组培养细胞培养细胞Tim3阳性细胞阳性细胞流式细胞仪流式细胞仪培养上清培养上清Th1Th2细胞因子细胞因子ELISA检测检测培养细胞内培养细胞内TLR4信号通路分子信号通路分子Western Blot细胞增殖试验细胞增殖试验MTTu课题选题合理，具有理论基础课题选题合理，具有理论基础u课题所采用的技术均已建立，在技术上课题所采用的技术均已建立，在技术上确保了本项目的完成确保

15、了本项目的完成 u本实验所需的仪器设备本单位基本齐全本实验所需的仪器设备本单位基本齐全 u计量资料计量资料:多个样本的比较采用方差分析，当方差不齐时多个样本的比较采用方差分析，当方差不齐时采用秩和检验采用秩和检验 多个样本的两组间比较采用多个样本的两组间比较采用SNK-q检验检验u计数资料计数资料:采用采用X2检验检验u等级资料：采用等级资料：采用Kruskal-Wallis H检验。检验。u P 0.05时有统计学意义时有统计学意义 Tim3/Tim3L信号通路在信号通路在Hp感染致感染致病及疫苗免疫中作用研究国内外未病及疫苗免疫中作用研究国内外未见报道见报道2011.12-2012.02

16、查阅相关文献，完成综述2012.03-2012.04 收集资料，完成各项准备工 作，进行预实验2012.05-2012.12 正式实验，并检测各项指标2013.01-2013.03 整理数据并分析，统计处 理，完成论文u激活激活Tim3/Tim3L信号通路可影响信号通路可影响Hp感染感染和和Hp疫苗免疫小鼠疫苗免疫小鼠Th免疫反应、免疫反应、TLR4信信号通路及号通路及Tregu通过调节通过调节Tim3/Tim3L信号通路可影响信号通路可影响Hp感染结局及感染结局及Hp疫苗免疫效果疫苗免疫效果u发表一篇发表一篇SCI论文，题目为论文，题目为Tim3/Tim3L信信号通路在幽门螺杆菌免疫致病及疫苗免疫号通路在幽门螺杆菌免疫致病及疫苗免疫中的作用及机制中的作用及机制 nBALB/C小鼠小鼠 2000元元n消耗材料费消耗材料费 8000元元nWestern Blot 20000元元n抗体抗体 70000元元nRT-PCR 10000元元n细胞因子检测试剂细胞因子检测试剂 15000元元n流式细胞检测费流式细胞检测费 20000元元n总计总计 135000元元