植物的器官培养课件.ppt

1、第六章第六章 植物的器官培养植物的器官培养【学习目的要求【学习目的要求】1 1一般掌握离体根培养的取材部位和培养基的选择。2 2掌握茎尖培养的种类和操作步骤。3 3掌握茎段培养中材料的选择、处理及培养基的调整。4 4掌握离体叶片的培养步骤。5 5一般掌握胚胎培养的类型与各自的注意事项。6.掌握如何防止培养过程中外植体的褐化和玻璃化。7.掌握植物器官组织培养常见问题的原因及对策【主要内容主要内容】第一节营养器官培养一、离体根培养一、离体根培养 二、茎尖培养二、茎尖培养 三、茎段培养三、茎段培养 四、离体叶培养四、离体叶培养 第二节生殖器官培养一、花器官和种子培养一、花器官和种子培养 二、胚胎培二

2、、胚胎培 三、胚珠培养三、胚珠培养 第三节 植物器官组织培养常见问题及对策第一节营养器官培养第一节营养器官培养一、离体根培养一、离体根培养 离体根培养特点：因为根系生长快，离体根培养特点：因为根系生长快，代谢强，变异小，加上无代谢强，变异小，加上无菌，不受微生物干扰，可根据研究需要，菌，不受微生物干扰，可根据研究需要，改变培养的成分来研改变培养的成分来研究其营养吸收、生长和代谢的变化。究其营养吸收、生长和代谢的变化。应用：研究根系生理和代谢变化；也可由根细胞再生成植株，不应用：研究根系生理和代谢变化；也可由根细胞再生成植株，不仅证明根细胞的全能性，也产生了无性繁殖系，用于生产实践仅证明根细胞的

3、全能性，也产生了无性繁殖系，用于生产实践。一、离体根培养一、离体根培养 培养方法：培养方法：1 1培养基培养基 用无机离子浓度低的用无机离子浓度低的WhiteWhite培养培养基，也可用基，也可用MSMS、B5B5等，但浓度为等，但浓度为2/32/3或或1/21/2。WhiteWhite培养基配方为：硝酸钾培养基配方为：硝酸钾8080，硫酸镁，硫酸镁720720，硫酸锰硫酸锰7 7，硫酸铜，硫酸铜0.030.03，碘化钾，碘化钾0.750.75，Vpp0.5,VB6 0.1,VB1 0.1,Vpp0.5,VB6 0.1,VB1 0.1,甘氨酸甘氨酸3(mg/L)3(mg/L)一、离体根培养一、

4、离体根培养2无性系的建立和培养、应用 1)将种子进行表面消毒，在无菌条件下用湿布培养萌发，至根伸长1.0cm以上。2)从根尖一端切取长1.2cm的尖端，接种于培养基中。3)培养物生长甚快，几天后发育出侧根。待侧根生长约一周后，即切取侧根的根尖进行接种培养，如此反复，得到离体根的无性系。4)这种根可用来进行根系生理生化和代谢方面的实验研究。如营养选择吸收、根尖伸长生长、生长素对伸长的影响等5)培养条件为暗光、2527。3植株再生培养 第一步诱导形成愈伤组织。第二步在再分化培养基上诱导芽的分化、再分化成小植株。二、二、茎尖培养茎尖培养 概念：是切取茎尖部分或茎尖分生组织部分，进行培养的过程。概念：

5、是切取茎尖部分或茎尖分生组织部分，进行培养的过程。这是组织培养中用得较多的外植体。因为茎尖分生区是三个分这是组织培养中用得较多的外植体。因为茎尖分生区是三个分区的主要部分。区的主要部分。茎尖培养可分为微茎尖培养和普通茎尖培养。茎尖培养可分为微茎尖培养和普通茎尖培养。1.1.微茎尖：指带有微茎尖：指带有1-21-2个叶原基的生长锥，其长度不超过个叶原基的生长锥，其长度不超过0.5mm0.5mm。2.2.普通茎尖：指取几普通茎尖：指取几mmmm到几十到几十mmmm长的顶芽尖及侧芽尖。这里主要介长的顶芽尖及侧芽尖。这里主要介绍后者绍后者 特点：技术简单，特点：技术简单，操作方便，易成活和分化，成苗时

6、间短。操作方便，易成活和分化，成苗时间短。步骤如下：步骤如下：1取材：挑选洁净、无污染，生长不久的茎，从植物的茎、藤或匍匐枝上切取2cm以上的顶梢。木本植物可事先对茎尖喷几次灭菌药剂。用于普通茎尖培养。2消毒 将采到的茎尖切成0.51.0cm长，并将大叶除去，休眠芽预先剥除鳞片。将茎尖置于流水冲洗干净，再在95%的酒精中处理30秒，然后在稀释20倍的次氯酸钠中浸5分钟，最后用无菌水冲洗数次，沥干后准备接种。3 接种 为了减少污染，在接种前再剥掉一些幼叶，使茎尖为0.5cm大小左右。用作快速繁殖。注意：一要防褐化。接种时，不用锈刀，动作敏捷，随切随接，用15%VC液浸泡处理。二要防干燥4 4培养

7、培养（1 1）培养基：）培养基：采用采用MSMS培养基或略加修改，或补加其它物培养基或略加修改，或补加其它物质。也可用其它培养基如质。也可用其它培养基如White,HellerWhite,Heller等。等。培养基中生长素是必须的，如培养基中生长素是必须的，如2,4-D2,4-D，IAA,IAA,NAANAA等，但等，但是浓度不能太高，一般用是浓度不能太高，一般用0.1mg/L0.1mg/L左右，若高易产生畸左右，若高易产生畸形芽或形成愈伤组织。形芽或形成愈伤组织。（2 2）培养问题处理：）培养问题处理：茎尖在培养过程中会出现生长太慢、茎尖在培养过程中会出现生长太慢、生长太快生长太快和生长正常

8、等三种类型。和生长正常等三种类型。I I 生长太慢：接种后茎尖不增大，只是茎尖逐渐生长太慢：接种后茎尖不增大，只是茎尖逐渐变绿，出现绿色小点，细胞逐渐老化而进入休变绿，出现绿色小点，细胞逐渐老化而进入休眠状态，眠状态，或者逐渐变褐死亡。引起原因的是或者逐渐变褐死亡。引起原因的是生长素浓度太低，或是温度过低或过高。生长素浓度太低，或是温度过低或过高。（2 2）培养问题处理：）培养问题处理：II II 生长太快型：是接种后茎尖迅速增大，在茎生长太快型：是接种后茎尖迅速增大，在茎尖基部产生愈伤组织，尖基部产生愈伤组织，并迅速增殖，而茎并迅速增殖，而茎尖不伸长，久之茎尖也形成愈伤组织，从而尖不伸长，久

9、之茎尖也形成愈伤组织，从而丧失发育成苗的能力。引起原因一是生长素丧失发育成苗的能力。引起原因一是生长素浓度过高，引起细胞疯狂分裂而导致愈伤组浓度过高，引起细胞疯狂分裂而导致愈伤组织的形成。织的形成。二是光照太弱或温度太高。二是光照太弱或温度太高。（2 2）培养问题处理：）培养问题处理：III III 生长正常型是接种后茎尖基部稍增大并形成生长正常型是接种后茎尖基部稍增大并形成少量愈伤组织，少量愈伤组织，茎尖颜色逐渐变绿，并逐茎尖颜色逐渐变绿，并逐渐伸长，叶原基发育成可见的小叶，进而形渐伸长，叶原基发育成可见的小叶，进而形成小苗。成小苗。（3 3）培养条件：）培养条件：o 培养时每天光照可长一些

10、，最长达培养时每天光照可长一些，最长达16h/d16h/d，照度，照度1500-3000Lx1500-3000Lx，温度，温度252522。并且根据不同植物种。并且根据不同植物种类，类，或者随培养过程的不同，给予适当的昼夜温或者随培养过程的不同，给予适当的昼夜温差等处理。差等处理。o 注意：防培养基干燥，由于茎尖培养时间较长，通注意：防培养基干燥，由于茎尖培养时间较长，通过定期转移、严加封口等。过定期转移、严加封口等。一般茎尖培养在一般茎尖培养在天左右可直接长成新梢。天左右可直接长成新梢。（4 4）继代培养）继代培养用茎段切割法。用茎段切割法。继代培养可用继代培养可用MS0MS0培养基。或用生

11、长物质较培养基。或用生长物质较低的低的MSMS培养基。培养基。也可边增殖边生根培养也可边增殖边生根培养（5 5）诱导生根）诱导生根I）用1/2 MS培养基，并只加入生长素类调节物质，如NAA、IBA等。注意浓度II）也可将切下的新梢基部浸入50或100ppm的IBA溶液处理48小时，然后转移到无激素的生根培养基中。III）注意较高浓度的生长素对生根有抑制作用。5.5.移栽驯化移栽驯化 指标：发现新梢基部生有较浓密的不定根，生长健壮而发达，长度在1cm以内。移栽：可先进行几天炼苗程，取出洗培养基栽入驯化器皿基质蛭石：珍珠岩：草炭土为1:1:0.5。栽后管理：1)初期保持湿度。基质浇透水，床面浇湿

12、，搭小拱棚等，并且初期要常喷雾处理。2)后期逐渐减少湿度。拱棚两端打开通风，减少喷水次数。以后揭去拱棚，并控制水分。温度管理上要掌握适宜的生根温度，最适宜的温度是1620，春季地温较低时，可用电热线来加温。光照：初期弱光照，加盖遮阳网或报纸等，后期可直接利用自然光照。移栽前的工作移栽前的工作o（1 1）培养瓶生壮苗）培养瓶生壮苗 加入生长控制剂，如多效唑，加入生长控制剂，如多效唑，B9B9，CCCCCC，其，其作用是使苗粗壮，叶绿素增加。作用是使苗粗壮，叶绿素增加。（2 2）炼苗）炼苗 将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐将瓶盖打开，打破无菌环境，湿度逐渐下降，光照逐渐加强，使之形成

13、新的功能强的根和叶片。一般炼苗时渐加强，使之形成新的功能强的根和叶片。一般炼苗时间为间为101030D30D。移栽时应注意的问题移栽时应注意的问题 （1 1）防止菌类滋生）防止菌类滋生 苗底部培养基要洗干净苗底部培养基要洗干净 杀菌剂处理苗的根部杀菌剂处理苗的根部 定时用杀菌剂处理种植基质定时用杀菌剂处理种植基质常用杀菌剂：常用杀菌剂：KMnO4KMnO4、百菌清、多菌灵、托、百菌清、多菌灵、托不津，使用浓度不津，使用浓度0.10.1（2 2）保持小苗水分供给平衡）保持小苗水分供给平衡 （3 3）移栽时选择合理的种植基质）移栽时选择合理的种植基质 基质要疏松透气，有适宜的保水性，易于基质要疏松

14、透气，有适宜的保水性，易于灭菌处理，不利于杂菌滋生：常用珍珠岩，椰灭菌处理，不利于杂菌滋生：常用珍珠岩，椰糠，蛭石，细沙，泥炭。糠，蛭石，细沙，泥炭。泥炭 珍珠岩 椰糠(4)注意一定光照，温度条件注意一定光照，温度条件 一般强度较高的慢射光较好一般强度较高的慢射光较好三、三、茎段培养茎段培养 概念：指不带芽和带概念：指不带芽和带1 1个以上定芽的，包括块茎、个以上定芽的，包括块茎、球茎在内的幼茎切段的无菌培养。球茎在内的幼茎切段的无菌培养。培养目的：快速繁殖。也可研究茎细胞的生理，培养目的：快速繁殖。也可研究茎细胞的生理，以及筛选突变体育种。以及筛选突变体育种。快繁优点：培养技术简单易行，繁殖

15、速度较快；快繁优点：培养技术简单易行，繁殖速度较快；芽生芽方式增殖的苗木质量好，且无病，性芽生芽方式增殖的苗木质量好，且无病，性状均一；解决不能用种子繁殖植物的快速繁殖状均一；解决不能用种子繁殖植物的快速繁殖问题等。问题等。1.1.材料选择和处理材料选择和处理 取生长健壮无病虫的幼嫩枝条或鳞茎盘，木本则取当年生嫩枝或一年生枝条,剪去叶片，剪成34cm的小段。注意：1）尽力取顶部茎切段和顶芽，但由于顶芽少可利用腋芽，但尽力用茎上部的腋芽。2）尽量在生长期取芽，休眠期成活率降低。如苹果在36月取材的成活率为60%，711月下降到10%，122月都在10%以下。1.1.材料选择和处理材料选择和处理

16、在自来水中冲洗在自来水中冲洗1 13 3小时，小时，用用75%75%酒酒精灭菌精灭菌30306060秒，秒，再用再用0.1%0.1%升汞浸泡升汞浸泡3 38 8分钟，分钟，或用饱和漂白粉浸泡或用饱和漂白粉浸泡10102020分钟，分钟，因材料老嫩和蜡质多少而定时间。因材料老嫩和蜡质多少而定时间。最后用最后用无菌水冲洗数次，以备接种。无菌水冲洗数次，以备接种。2 2培养过程培养过程 o 培养选MS培养基，加入3%蔗糖，用0.7%的琼脂固化。培养条件保持25左右，给予充分的光照和光期。o 培养物的变化：1）基部切口上长出愈伤组织，呈现稍许增大，控制不要过大。2）而芽开始长长，有时会出现丛生芽，培养

17、方式或是培养出芽梢或是培养芽丛，从而得到无菌苗。o 培养基：促进腋芽增殖用6-BA是最为有效的，依次为Kt和Zt等。生长素虽不能促进腋芽增殖，但可改善苗的生长，也要适量加入。GA对芽伸长有促进作用。2 2培养过程培养过程p继代扩繁：包括二种途径，一是促进腋芽的快速生长；二是诱导形成大量不定芽。第一种途径的好处是不会产生变异，能保持品种优良特性。且方法简便，可在各种植物上使用，每年从一个芽可增殖10万株以上。第二种途径虽会产生变异，繁殖系数较高，适于多数植物。p生根培养和移栽驯化与茎尖培养相似，不再重复。p同样注意驯化管理。要进行炼苗，小心移栽，初期湿度要大，基质通气湿润，保湿保温，特别要精心管

18、理等。四、四、离体叶培养离体叶培养 p 离体叶培养:包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养。它大多经脱分化形成愈伤组织，再经再分化生出不定芽和不定根。p 应用：不仅可用于研究形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题，而且也是繁殖稀有名贵品种的有效手段 四、四、离体叶培养离体叶培养o叶培养特点：材料来源广泛，数量大，容易培养，尤其对木本叶培养特点：材料来源广泛，数量大，容易培养，尤其对木本植物，生成的愈伤组织完整，数量多，较迅速等。植物，生成的愈伤组织完整，数量多，较迅速等。o叶片再生能力：叶片再生能力：以羊齿植物最多，双子叶植物次之，单子以羊齿植物最多，双子叶植物次之，单子叶

19、植物最少。叶植物最少。o再生方式：再生方式：一种是直接诱导形成不定芽，另一种是先诱导形一种是直接诱导形成不定芽，另一种是先诱导形成愈伤组织，再经愈伤组织分化成植株。成愈伤组织，再经愈伤组织分化成植株。叶的离体培养技术如下：叶的离体培养技术如下：材料选择及灭菌 选择健康洁净的植株，取其较幼嫩叶片，冲洗干净，用70%酒精漂洗约10秒，再在饱和漂白粉液中浸315分钟，或在0.1%升汞中浸35分钟，以前者为佳。用无菌水冲洗数次，再放在无菌的干滤纸上吸干水分，以供接种用。对一些粗糙或带茸毛的叶片要延长灭菌时间。注意要选择成熟的叶片。叶的离体培养技术如下：叶的离体培养技术如下：.接种 将叶片切成约0.5c

20、m见方小块或圆片及薄片（如叶柄和子叶），注意选择切块位置。MS培养基附加BA13，NAA0.251。3.培养 培养条件为每天1012小时光照，光强15003000Lx。3.培养 1）培养24周，叶切块开始增厚肿大，进而形成愈伤组织。2）转移到分化培养基上进行培养，其培养基的BA含量为2左右，约再过10天左右，愈伤组织开始转绿出现绿色芽点，形成不定芽。通过继代培养和生根培养，完成整个组培过程。3.培养o 叶的培养比胚，茎尖和茎段培养难度大。首先要选用易培养成功的叶组织，如幼叶比成熟叶易培养，子叶比叶片易培养。其次要添加适当的生长素和细胞分裂素浓度，保证利于叶组织的脱分化和再分化。第二节生殖器官培

21、养一、一、花器官和种子培养花器官和种子培养（一）花器官培养（一）花器官培养 花器官培养花器官培养：指整个花器及其组成部分如花托、花瓣、花丝、指整个花器及其组成部分如花托、花瓣、花丝、花柄、子房、花药等的无菌培养。子房和花药培养另有专门叙花柄、子房、花药等的无菌培养。子房和花药培养另有专门叙述。述。应用：应用：理论上通过离体花芽培养可了解整体植物和内源激素在理论上通过离体花芽培养可了解整体植物和内源激素在花芽性别决定中所起的作用。花芽性别决定中所起的作用。可以了解花器各部分对果实和可以了解花器各部分对果实和种子发育的作用，种子发育的作用，以及内、外源激素在果实种子发育过程中以及内、外源激素在果实

22、种子发育过程中的调控作用。生产上可用于珍贵品种的扩大繁殖。的调控作用。生产上可用于珍贵品种的扩大繁殖。培养方法如下：培养方法如下：1取材 从健壮植株上取未开放的花蕾，已经开花的不宜用，因为消毒困难。先用75%酒精消毒约30秒钟，再用饱和漂白粉浸1015分钟，取出用无菌水冲洗数次。2接种培养 用整个花蕾培养时，只要把花梗插入培养基中。若用花器，则分别取下切成小片。2接种培养 I)I)培养基：培养基：MSMS、B5B5等。若让花器官育成小植株，要用诱导培养等。若让花器官育成小植株，要用诱导培养基，加入生长激素和细胞分裂素，先形成愈伤组织或胚状体，基，加入生长激素和细胞分裂素，先形成愈伤组织或胚状体

23、，再分化培养成植株。如菊花的花瓣片接在含再分化培养成植株。如菊花的花瓣片接在含6-BA 2mg/L6-BA 2mg/L、NAA NAA 0.20.2的的MSMS培养基上，形成少量愈伤组织。再经培养基上，形成少量愈伤组织。再经1 1个月就分化出绿色个月就分化出绿色芽点，再切割转接，可形成大量无根苗，用于繁殖。芽点，再切割转接，可形成大量无根苗，用于繁殖。II)26II)261500Lx1500Lx光照，每天光照光照，每天光照1010小时，小时，培养约培养约2 2周周（二）种子培养（二）种子培养 o种子培养是指受精后发育完全的成熟种子和发育不完全的未成种子培养是指受精后发育完全的成熟种子和发育不完

24、全的未成熟种子的无菌培养。这项技术广泛地应用于花卉、蔬菜、果树、熟种子的无菌培养。这项技术广泛地应用于花卉、蔬菜、果树、农作物等的种子培养之中。农作物等的种子培养之中。o优点：可以打破种子休眠，特别对一些休眠期长的植物；优点：可以打破种子休眠，特别对一些休眠期长的植物；可可以作为大量生产试管苗的好材料，它分化容易，以作为大量生产试管苗的好材料，它分化容易，无菌操作方无菌操作方便。可使远缘杂交产生的杂种败育种子，正常萌发产生第二代便。可使远缘杂交产生的杂种败育种子，正常萌发产生第二代植株。植株。培养技术如下：培养技术如下：1种子灭菌 种皮厚或不饱满的种子，宜用0.1%升汞消毒1020分钟。幼嫩的

25、或发育不全的种子，宜用饱和漂白粉消毒1530分钟。若种子上有绒毛或蜡质，应先用95%酒精或吐温40处理，提高消毒效果。对壳厚难萌发的种子，可去壳培养。培养技术如下：培养技术如下：2 2培养基培养基 若以种子萌发为目的，培养基可不加或少加生长若以种子萌发为目的，培养基可不加或少加生长激素。对某些发育不全的无胚乳的种子培养，应提供适激素。对某些发育不全的无胚乳的种子培养，应提供适当的生长激素。种子培养的糖浓度可稍低，一般当的生长激素。种子培养的糖浓度可稍低，一般1 13%3%。3 3接种培养接种培养 种子培养的接种较容易，每瓶种子培养的接种较容易，每瓶3 35 5粒，粒，均均匀排列，匀排列，4.4

26、.培养条件：培养条件：20202828，100010002000Lx2000Lx光强，每天光照光强，每天光照1010小小时时二、二、胚胎培养胚胎培养 o胚及胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌条件下，使胚发育成幼苗的技术。包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等。o胚胎培养史：已有近百年，1904年的Haning首次培养了萝卜和辣椒的胚，并萌发形成小苗。30年代把兰科植物的胚培养成小植株。40年代进行苹果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、马铃薯、甘蓝与大白菜的种间杂种的胚胎培养、胚乳培养及子房与胚珠培养。（一）胚胎培养的意义（一）胚胎培养的意义 1.克服远缘杂种的不育性 用胚胎培养和试管

27、受精技术，解决种间和属间胚败育，胚发育不全，而不能正常萌发的问题。2.使胚发育不全的植物获得后代。如兰花、天麻的种子成熟时，胚只有67个细胞，多数胚不能成活。分离出这此些未成熟胚进行培养，得到正常植物。3.缩短育种年限 应用胚培养技术可以缩短育种周期12年。（二）离体胚培养（二）离体胚培养 o 胚发育过程：受精胚发育过程：受精受精卵受精卵合子合子第一次第一次分裂分裂分生组织和幼胚分生组织和幼胚成熟胚。在这个过成熟胚。在这个过程，胚靠消耗胚乳的营养而发育，程，胚靠消耗胚乳的营养而发育，同时胚同时胚处在胚囊环境中，可吸收氨基酸、维生素等处在胚囊环境中，可吸收氨基酸、维生素等营养。营养。离体胚培养包

28、括成熟胚和幼胚培养离体胚培养包括成熟胚和幼胚培养成熟胚培养 指子叶期后至发育完全的胚。培养较易成功，在含有无机大量元素和糖的培养基上，就能正常生长成幼苗。将成熟或未成熟种子70%酒精表面消毒无菌水冲洗34次无菌条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养上培养。幼胚培养 幼胚是指子叶期以前的幼小胚，现在可对心形期胚或更早期(0.10.2mm)的胚进行培养。胚越小就越难培养，现在大麦、荠菜、甘蔗、甜菜、胡萝卜等幼胚已培养成功。I)I)操作方法操作方法 o 与成熟胚培养基本相同，切取幼胚必须在高倍解剖镜下进行，操作时要特别细心，尽量取出完整的胚。II)II)培养方式培养方式 常见有三种明显不同的生长方

29、式：常见有三种明显不同的生长方式：第一种是继续进行正常的胚胎发育，第一种是继续进行正常的胚胎发育，维持维持“胚性生长胚性生长”；第二种是在培养后迅速萌发成幼苗，第二种是在培养后迅速萌发成幼苗，而不继续进行胚性而不继续进行胚性生长，通常称为生长，通常称为“早熟萌发早熟萌发”；第三种是发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此再分化形成第三种是发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此再分化形成多个胚状体或芽原基。多个胚状体或芽原基。特别是加有生长调节剂时，就特别是加有生长调节剂时，就更为如此。更为如此。III)III)影响因素影响因素 1.培养基培养基 成熟胚对培养基要求不高，而幼胚要求较高，常用的培成熟胚对培养基

30、要求不高，而幼胚要求较高，常用的培养基有养基有Tukey、MS、B5、Nitsch培养基，其中前者适于成熟培养基，其中前者适于成熟胚培养，其它适于未成熟胚和幼胚培养。胚培养，其它适于未成熟胚和幼胚培养。幼胚需要较高的蔗糖浓度，幼胚需要较高的蔗糖浓度，提供较高的渗透压。由于幼胚提供较高的渗透压。由于幼胚在自然条件下赖以生存的是无定形的液体胚乳，在自然条件下赖以生存的是无定形的液体胚乳，具有较高的渗具有较高的渗透压，人工培养基中要创造高渗透压的条件，透压，人工培养基中要创造高渗透压的条件，它可以调节胚的它可以调节胚的生长，阻止可能的渗透压影响，生长，阻止可能的渗透压影响，还能抑制早熟萌发中的细胞延

31、还能抑制早熟萌发中的细胞延长，以及抑制胚的萌发，避免把细胞的伸长状态转化为分裂状态。长，以及抑制胚的萌发，避免把细胞的伸长状态转化为分裂状态。III)III)影响因素影响因素2.生长调节物质 不同植物的胚培养需要的生长物质不同，如IAA可明显促进向日葵胚的生长。IAA,Kt的共同作用可促进荠菜幼胚的生长。一般认为IAA可使胚的长度增加；加入BA可提高胚的生存机会。3.天然提取物 椰乳对胚培养有一定的促进作用，如番茄胚在含有50%椰乳的培养基中可维持生长。瓜类的胚乳提取物也能促进胚生长的能力，可能是植物激素的细胞分裂物质和一些有机氮化合物作用的结果。4.温光条件 大多数植物的胚在2530为宜，但

32、是，早熟果树(如桃)必须经过一定的低温春化阶段才能正常萌发生长。光照可以促进某些植物的胚转绿，利于胚芽生长，而黑暗利于胚根生长。因此以光暗交替培养较为有利。5.其它条件 胚培养中还要求较高浓度的氨基酸及无机盐。三、胚珠培养三、胚珠培养 o 概念概念：在无菌条件下对授粉的子房取出胚珠进行培养的过程。有时也把胚珠连同胎座一起取下来培养。o 优点：优点：胚珠培养可以解决象兰科植物成熟胚较小不易培养的问题。另一方面在未受精的胚珠培养中，可诱发大孢子发育成单倍体，用于单倍体育种。三、胚珠培养三、胚珠培养o 接种和培养基：接种和培养基：从花中取出子房进行表面消毒，在无菌条件下进行解剖，取出胚珠，放在培养基

33、上培养；多用Nistch培养基，也可采用MS、N6、B5等培养基。o 注意：注意：关键是选择胚的发育时期，实验证明发育到球形胚期的胚珠较易培养成功。另外可取用带胎座甚至带部分子房的胚珠进行培养。四、胚乳培养四、胚乳培养 o 概念概念：指对由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的三倍体组织的培养。可获得无子结实的三倍体植株，进而可将它加倍成六倍体植株。o 接种和培养基接种和培养基：取授粉48天后的幼果，常规消毒后，在无菌条件下切开果实，取出种子，小心分离出胚乳。接种在培养基上；培养过程：培养过程：I)I)接入接入MSMS、WhiteWhite等培养基，附加等培养基，附加2 2，4-D4-D或或

34、NAA 0.5NAA 0.52.02.0，BA0.1BA0.11.01.0。在。在25252727和黑暗条件或散射光下培养和黑暗条件或散射光下培养,约约6-106-10天胚乳开天胚乳开始膨大始膨大,形成愈伤组织；形成愈伤组织；II)II)转入分化培养基转入分化培养基,MS,MS培养基附加培养基附加0.50.53.0 mg/l3.0 mg/l的的BABA及少量的及少量的NAANAA。使愈伤组织长出芽。使愈伤组织长出芽。III)III)切下不定芽切下不定芽,插入生根培养基中，光下培养插入生根培养基中，光下培养10101515天天,切口处可切口处可长出白色的不定根。长出白色的不定根。第三节第三节 植

35、物器官组织培养常见问题及对策植物器官组织培养常见问题及对策一、污染及控制一、污染及控制 1 1、污染的含义：、污染的含义：指在组培过程中培养瓶内滋生菌斑，使培养材料不能正常生长发指在组培过程中培养瓶内滋生菌斑，使培养材料不能正常生长发育，从而导致培养失败的现象。育，从而导致培养失败的现象。2 2、污染原因（从病原菌分析）、污染原因（从病原菌分析）（1）细菌污染：菌斑呈黏粘液状，界限比较明显，一般接种后12天即能发现。主要是大肠杆菌和链球菌。（2）真菌污染：菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有不同颜色的孢子接种后310天才能发现。主要是霉菌污染。3、污染途径 （1）外植体带菌（2）培养基及接种器

36、具灭菌不彻底（3）接种操作时带入（4）环境不清洁4 4、污染的预防措施、污染的预防措施 A A、防止外植体带菌防止外植体带菌（1 1）选择好外植体采集时期和采集部位选择好外植体采集时期和采集部位 外植体采集以春秋为宜；外植体采集以春秋为宜；优先选择地上部分作为外植体；优先选择地上部分作为外植体；阴雨天勿采，晴天下午采集；阴雨天勿采，晴天下午采集；采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。（2 2）室内或无菌条件下进行预培养。）室内或无菌条件下进行预培养。（3 3）外植体严格灭菌）外植体严格灭菌 灭菌效果实验灭菌效果实验 多次灭菌和交多次灭菌和交替灭菌替灭菌 B B、保证培养

37、基及接种器具彻底灭菌、保证培养基及接种器具彻底灭菌 1 1、分装时，注射器勿触瓶口。培养基勿粘瓶口、分装时，注射器勿触瓶口。培养基勿粘瓶口2 2、检查封口膜是否破损、检查封口膜是否破损3 3、扎瓶口要位置适当，松紧适宜、扎瓶口要位置适当，松紧适宜4 4、保证灭菌时间和高压锅内温度、保证灭菌时间和高压锅内温度5 5、接种工具用前彻底灭菌、接种工具用前彻底灭菌6 6、工作服、口罩、帽子等布质品定期进行湿热灭菌、工作服、口罩、帽子等布质品定期进行湿热灭菌 C C、操作人员严格遵守无菌操作规程、操作人员严格遵守无菌操作规程D D、保证接种与培养环境清洁保证接种与培养环境清洁 （1 1）污染瓶经高压灭菌

38、后再清洗）污染瓶经高压灭菌后再清洗（2 2）接种环境定期熏蒸消毒、紫外灯照射，或用臭）接种环境定期熏蒸消毒、紫外灯照射，或用臭氧灭菌机消毒氧灭菌机消毒（3 3）定期清洗或更换超净台初过滤器，进行带菌实）定期清洗或更换超净台初过滤器，进行带菌实验；接种前验；接种前151520min20min打开风机，风速调整到打开风机，风速调整到202030m/min30m/min，并对台面用，并对台面用75%75%酒精喷雾消毒酒精喷雾消毒（4 4）定期对培养室消毒，防止高温）定期对培养室消毒，防止高温 二、培养物的不良表现及改进措施二、培养物的不良表现及改进措施（一）初始培养阶段（一）初始培养阶段1.1.培养

39、物水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯培养物水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位或时期）。可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位或时期）。改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。初期取材。2.2.培养物长期培养几乎无反应培养物长期培养几乎无反应可能原因：基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度不适宜。可能原因：基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度不适宜。改进措施：更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是

40、调整盐离子浓度，增加生长素用改进措施：更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度，增加生长素用量，试用量，试用2,4-D2,4-D，调整培养温度。，调整培养温度。（一）初始培养阶段（一）初始培养阶段3.3.愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状可能原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。可能原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度。铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度。4.4.愈伤组织

41、太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢可能原因：细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。可能原因：细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。低糖浓度。（一）初始培养阶段（一）初始培养阶段5.5.侧芽不萌发侧芽不萌发,皮层过于膨大皮层过于膨大,皮孔长出愈伤组织皮孔长出愈伤组织 可能原因可能原因:枝条过嫩枝条过嫩,生长素、细胞分裂素用量过多。生长素、细胞分裂素用量过多。改进措施：减少激素用量，采用较老化枝条。改进措施：减少激素

42、用量，采用较老化枝条。6 6、初代培养外植体的褐变、初代培养外植体的褐变 外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐化，有时甚至会使整个培养外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐化，有时甚至会使整个培养基褐化的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，基褐化的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。（1

43、1）褐变的主要原因如下）褐变的主要原因如下 植物品种植物品种 研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。由于多酚氧化酶，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此，在培养过程酶，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。生理状态生理状态 由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的同。一般来说，处于幼龄期的植物材料

44、褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。一般来植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。变程度较为严重。培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。（2 2）减轻褐变现象发生的方法

45、）减轻褐变现象发生的方法 选择合适的外植体选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。样可以使褐变现象明显减轻。合适的培养条件合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、及时继代培养均无机盐成分、植物生长物质水平、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。可以减轻材料的褐变现象。使用抗氧化剂使用抗氧化剂 半胱氨酸及其盐酸盐、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、抗坏半胱氨酸及其盐酸盐、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、抗坏血酸等。该类药剂一般需用浓度为血酸等。该类药剂一般需用浓度为50-200mg/L50-200mg/L。用经过滤灭菌的药。

46、用经过滤灭菌的药液洗涤刚切割的外植体伤口表面，或加入固体培养基的表层，或将液洗涤刚切割的外植体伤口表面，或加入固体培养基的表层，或将刚切割的外植体浸入其中一定时间。另外，使用刚切割的外植体浸入其中一定时间。另外，使用0.1%-0.5%0.1%-0.5%的活性炭的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。对防止褐变也有较为明显的效果。PVPPVP处理。处理。连续转移连续转移 对容易褐变的材料可间隔对容易褐变的材料可间隔121224h24h的培养后，再转移到新的的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理培养基上，这样经过连续处理7-l0d7-l0d后，褐变现象便会得到控制或大后，褐变现象便会得到控

47、制或大为减轻。为减轻。（二）继代培养阶段（二）继代培养阶段1.苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高可能原因：细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。改进措施：增加细胞分裂素用量，适当降低温度，改善光照，改单芽继代为团块（丛芽）继代。2.苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗丛密集，微型化。可能原因：细胞分裂素用量过多，温度不适宜。改进措施：减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。（二）继代培养阶段（二）继代培养阶段3.分化率低,畸形,培养时间长时苗再次愈伤组织化可能原因:生长素用量偏高,温度偏高。改进措施：减少生长素用量，适当降温。4.叶粗厚变脆 可能原因：生长素用量偏高，或兼有细

48、胞分裂素用量偏高。改进措施：适当减少激素用量，避免叶片接触培养基 5.再生苗的叶缘、叶面等外偶有不定芽分化出来可能原因：细胞分裂素用量偏高，或表明该种植物适于该种再生方式。改进措施：适当减少细胞分裂素用量，或分阶段地利用这一再生方式（二）继代培养阶段（二）继代培养阶段6.丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽可能原因：细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，温度过高，光照短，光强不足，久不转移，生长空间窄。改进措施：减少细胞分裂素用量，免用赤霉素，延长光照时间，增强光照，及时转接，降低接种密度。7.幼苗淡绿，部分失绿可能原因：无机盐含量不足，PH值不适宜，铁、锰、镁等缺少或比例失调，光照、温度不适。改进

49、措施：针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好PH值，调控温度、光照。8.幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中 可能原因：瓶内气体状况恶化，PH值变化过大，久不转接导致糖已耗尽，营养元素亏缺失调，温度不适，激素配比不当、缺铁等。改进措施：及时转接、降低接种密度，调整激素配比和营养元素浓度，改善瓶内气体状况，控制温度。（二）继代培养阶段（二）继代培养阶段9、继代培养时材料的玻璃实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生理失调症。因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生

50、根，因此，使繁殖系数大为降低。在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异。当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现象。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。（二）继代培养阶段（二）继代培养阶段呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的，其具体解决的方法为其具体解决的方法为 增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；减少培养基中含氮化合物的用量；增加光照；增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃