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1、南华大学心血管病研究所，动脉硬化学湖南省重点实验室南华大学心血管病研究所，动脉硬化学湖南省重点实验室报告人报告人:尹凯（博士研究生）尹凯（博士研究生）导导 师：唐朝克（教授）师：唐朝克（教授）TOLL样受体适配蛋白样受体适配蛋白MyD88 偶联偶联胆固醇逆向转运与炎症胆固醇逆向转运与炎症KA Smoak,et al.Cell Metabolism,Jun 2010;11(6):493-502.（IF：17.35）一、研一、研 究究 背背 景景1 1、高密度脂蛋白（、高密度脂蛋白（HDL）与心血管疾病的风险呈负相关，促）与心血管疾病的风险呈负相关，促进胆固醇逆向转运（进胆固醇逆向转运（RCT）是

2、其抗动脉粥样硬化（）是其抗动脉粥样硬化（AsAs）的关）的关键机制。键机制。3 3、最新的研究显示、最新的研究显示apoA-I/ABCA1 途径具有抗炎作用，将为途径具有抗炎作用，将为As的防治提供新的思路。的防治提供新的思路。2 2、ApoA-I/ABCA1 途径介导细胞内胆固醇流出，是途径介导细胞内胆固醇流出，是RCTRCT的关的关键环节，也是目前研究最多的领域键环节，也是目前研究最多的领域。二、二、ApoA-I/ABCA1途径抗炎的可能机制途径抗炎的可能机制Kai yin,Duan-fang Liao,Chao-ke tang.ABCA1:A Possible Link Between

3、Inflammation And Reverse Cholesterol Transport.Mol Med,Sep 2010;16(9-10):438-49.(IF:5.02 )?三、研三、研 究究 方方 法法1 1、以脂多糖（、以脂多糖（LPS）处理的）处理的THP-1巨噬细胞作为炎症细胞模巨噬细胞作为炎症细胞模 型，观察型，观察apoA-I对对TNF表达的影响。表达的影响。2 2、采用核连缀试验观察、采用核连缀试验观察apoA-I对对TNF 转录的影响转录的影响。3 3、利用放线菌素、利用放线菌素D终止转录，观察终止转录，观察apoA-I 对对TNF mRNA降解降解 的影响的影响。4

4、4、利用、利用SiRNA干扰等技术干扰等技术探讨探讨apoA-I 促进促进TNF mRNA降解降解 的分子机制的分子机制。第一部分第一部分:ApoA-I:ApoA-I通过转录后途径调节通过转录后途径调节TNFTNF表达表达四、研四、研 究究 结结 果果图图1.ApoA-I下调下调LPS诱导的诱导的TNF-蛋白水平蛋白水平图图1.1.Western-blot检测检测TNF-的的蛋白质蛋白质表达表达图图2.核连缀实验显示核连缀实验显示apoA-I对对TNF转录无明显影响转录无明显影响图图2 2：核连缀转录分析检测：核连缀转录分析检测apoA-I对对TNF-转录的影响转录的影响图图3.ApoA-I显

5、著下调显著下调LPS诱导的诱导的TNF-mRNA水平水平图图3.3.荧光定量荧光定量PCR检测检测TNF-的的mRNA表达水平表达水平图图4.ApoA-I促进促进TNF mRNA的降解的降解图图4.4.放线菌素放线菌素D（act D）终止转录，）终止转录，检测不同时间点检测不同时间点TNF的的mRNA水平。水平。图图5.含含TNF-3UTR的的CAT报告基因的构建报告基因的构建pCAT-controlpCAT-TNF-3UTRpCAT-TNF-3UTR-AREpCAT-TNF-3UTR-AREmut图图5.5.构建含构建含TNF-3UTR不同序列的不同序列的 氯霉素乙酰转移酶（氯霉素乙酰转移酶

6、（CAT）报）报告基因载体，转染告基因载体，转染THP-1巨噬细胞巨噬细胞。图图6.ApoA-I通过通过TNF 3UTR ARE促进促进mRNA降解降解第二部分第二部分:ApoA-I:ApoA-I通过通过TTPTTP促进促进TNFmRNATNFmRNA降解降解四、研四、研 究究 结结 果果图图1.1.ApoA-I上调上调Tristetraprolin(TTP)的表达的表达图图1.1.Western-blot检测检测TTP的的蛋白质蛋白质表达表达图图2.2.TTP siRNA抑制抑制apoA-I对对TNF的下调作用的下调作用图图2A.2A.Western-blot检测检测TTP SiRNA效果效

7、果图图2B.2B.TTP SiRNA抑制抑制apoA1对对TNF的下调作用的下调作用AB图图3.TTP siRNA抑制抑制apoA-I对对TNFmRNA的降解的降解图图3.3.PCR检测检测TTP SiRNA对对apoA1促进促进TNF-mRNA降解的影响降解的影响第三部分第三部分:ApoA-I:ApoA-I通过激活通过激活STAT3STAT3促进促进TTPTTP的表达的表达四、研四、研 究究 结结 果果图图1.ApoA-I激活激活THP-1细胞细胞STAT3图图1A.1A.Western-blot检测检测apoA1对对p-STAT3表达的影响表达的影响图图1B.1B.Western-blot

8、检测检测apoA1对核内对核内STAT3表达的影响表达的影响AB图图2.阻断阻断STAT3抑制抑制apoA-I对对TTP的上调作用的上调作用图图2A.2A.Western-blot检测检测AG490对核内对核内STAT3表达的抑制作用表达的抑制作用图图2B.2B.Western-blot检测检测AG490对对apoA1促进促进TTP表达的影响表达的影响AB第四部分第四部分:ApoA-I:ApoA-I通过通过ABCA1ABCA1激活激活STAT3/TTPSTAT3/TTP途径途径四、研四、研 究究 结结 果果图图1.ABCA1介导介导apoA-I对对STAT3的激活作用的激活作用ABB图图1A.

9、1A.Western-blot检测检测普罗布考对普罗布考对ABCA1表达的影响表达的影响图图1B.1B.Western-blot检测检测普罗布考对普罗布考对apoA1作用下作用下STAT3磷酸化的影响磷酸化的影响图图2.阻断阻断ABCA1抑制抑制apoA-I对对TTP的上调作用的上调作用图图2.2.Western-blot检测检测普罗布考对普罗布考对apoA1作用下作用下TTP表达的影响表达的影响图图3.阻断阻断ABCA1抑制抑制apoA-I对对TNFmRNA的降解的降解图图3.3.荧光定量荧光定量PCR检测检测普罗布考对普罗布考对apoA1促进促进TNF-mRNA降解的影响降解的影响五、讨五、讨 论论TLR4六、结六、结 论论1.1.ApoA-I通过转录后调控方式抑制通过转录后调控方式抑制LPS诱导的诱导的TNF-表达；表达；2.2.ApoA-I促进促进TTPTTP表达，并通过表达，并通过TNF-3UTR ARE促进其促进其 mRNA降解；降解；ApoA-I通过激活通过激活STAT3促进促进TTP表达，该效应直接受表达，该效应直接受ABCA1 介导。介导。Any question?Thank you！