WATERS液相色谱教程三四七最全学习教案课件.pptx

1、会计学1WATERS液相色谱教程三四七最全液相色谱教程三四七最全第1页/共141页第2页/共141页第3页/共141页第4页/共141页第5页/共141页第6页/共141页第7页/共141页2 星期1 天1 星期1 小时新鲜配制5101520250分测试条件测试条件水样水样:40ml trace enrichment 2.0 ml/min色谱柱色谱柱:C18 反相柱反相柱(Waters)梯度梯度:线性线性 100%水水 100%乙腈乙腈波长波长:254 nm第8页/共141页1 天1星期新鲜配制5101520250分测试条件测试条件水样水样:40ml trace enrichment 2.0

2、ml/min色谱柱色谱柱:C18 反相柱反相柱(Waters)梯度梯度:线性线性 100%水水 100%乙腈乙腈波长波长:254 nm第9页/共141页第10页/共141页第11页/共141页Waters 600泵的前面板泵的前面板柱塞杆柱塞杆清洗孔清洗孔电源开关电源开关排液阀排液阀泵控制器泵控制器泵体泵体泵灌注阀泵灌注阀第12页/共141页溶剂瓶盘溶剂瓶盘注射器箱门注射器箱门柱温箱柱温箱溶剂配比单元溶剂配比单元进入门进入门检测器接液盘检测器接液盘前面板显示前面板显示屏和键盘屏和键盘 软盘驱动器软盘驱动器样品室门样品室门溶剂输送单溶剂输送单元进入门元进入门第13页/共141页2695排气操作示

3、意图排气操作示意图面板操作面板操作 :打开状态打开状态(Statas)画画面面 按右下角按右下角Direct Function功能键功能键选选 Dry Pime或或 Wet Prime命令命令选选OK 即可进行泵的排气即可进行泵的排气注注:当流路中充满空气时当流路中充满空气时,按图示做按图示做Dry Prime若只是更新流动相时若只是更新流动相时,只须作只须作Wet Prime第14页/共141页关于色谱系统的反压关于色谱系统的反压什么是反压什么是反压(back pressure)流动相流经管路及色谱柱时会有阻力流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反即所谓的反压压,又称系统反压或系统压力

4、又称系统反压或系统压力Waters习惯用的压力单位是习惯用的压力单位是Psi(磅磅/平方英吋平方英吋)其它单位有其它单位有:Bar,Mpa影响系统反压的主要因素影响系统反压的主要因素:流动相的溶剂组成流动相的溶剂组成温度温度流速流速第15页/共141页反压与溶剂组成的关系反压与溶剂组成的关系Pressure vs.Organic-Water Percentage02004006008001000120014001600020406080100Percent Organic SolventpsiMeOHACN流动相的粘度是产生反压的主要原因流动相的粘度是产生反压的主要原因有机溶剂水的粘度随组成而

5、改变有机溶剂水的粘度随组成而改变其压力随组成变化如下图所示其压力随组成变化如下图所示第16页/共141页反压与流速的关系反压与流速的关系流速对反压的影响是线性关系流速对反压的影响是线性关系流速增加，反压亦增大流速增加，反压亦增大 下图的实验条件：下图的实验条件：2.130mm Symmetry C18柱柱,20Pressure vs.Flow Rate at 20 C05001000150020002500300035004000450050000.00.20.40.60.81.01.2mL/minpsi50%MeOH50%ACN100%H2O100%MeOH100%ACN第17页/共141页

6、反压与温度的关系反压与温度的关系温度对反压的影响是反比关系温度对反压的影响是反比关系温度升高温度升高,反压降低反压降低,对某些流动相的影响更大一些对某些流动相的影响更大一些 Pressure vs.Temperature050010001500200025003000350040004500500010.020.030.040.050.060.070.0Degrees,Cpsi50%MeOH50%ACN100%H2O100%MeOH100%ACN第18页/共141页影响系统反压的其它因素影响系统反压的其它因素反压与色谱柱长度成正比反压与色谱柱长度成正比反压与填料颗粒度的平方成反比反压与填料颗粒

7、度的平方成反比2.5m2.5m填料比填料比3.5m3.5m填料反压高填料反压高反压与管路直径的四次方成反比反压与管路直径的四次方成反比 (1/D(1/D4 4)反压与管路的长度成正比反压与管路的长度成正比第19页/共141页第20页/共141页第21页/共141页第22页/共141页第23页/共141页第24页/共141页第25页/共141页第26页/共141页第27页/共141页第28页/共141页第29页/共141页第30页/共141页第31页/共141页第32页/共141页NNOHOONO+NOR1R2HNNOOOHNH20NH2NOOOHN+AQC衍生试剂及氨基酸衍生后的氨基酸CO2N

8、-羟基琥珀酰亚胺N-羟基琥珀酰亚胺半衰期1秒半衰期约15秒6-氨基喹啉第33页/共141页第34页/共141页亲亲水水-亲亲脂脂平衡共聚物平衡共聚物“亲水亲水”使填料具有水可浸润性质使填料具有水可浸润性质降低与水的接触角降低与水的接触角“亲脂亲脂”提供对被分析物质的提供对被分析物质的反相保留能力反相保留能力NO亲水性单体亲水性单体 N-乙烯基吡咯烷酮乙烯基吡咯烷酮亲脂性单体亲脂性单体 二乙烯基苯二乙烯基苯第35页/共141页活化/平衡1ml 甲醇甲醇/1ml 水水上样多至多至 200 ml 样品样品冲洗废弃物1ml 5%甲醇甲醇/水溶液水溶液洗脱想要的化合物1ml 甲醇甲醇挥发溶剂并重新定容制

9、备样品这是适合于分析这是适合于分析众多基质中大多数样众多基质中大多数样品的通用操作步骤品的通用操作步骤建议首先使用这建议首先使用这种通用的操作步骤种通用的操作步骤如果需要进一步如果需要进一步降低干扰物的影响，降低干扰物的影响，可使用可使用二维二维SPE方法方法注注:此方法于规格为此方法于规格为3cc,60mg的的OasisHLB 小柱上开发小柱上开发第36页/共141页SPE处理处理的效果的效果第37页/共141页第38页/共141页第39页/共141页第40页/共141页流动相洗针溶剂缓冲溶液，反相50%水 50%甲醇纯缓冲溶液100%水非水溶液，反相100%甲醇正相流动相GPC流动相离子交

10、换对离子试剂的水溶液洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：第41页/共141页通流动相平衡至少通流动相平衡至少30分钟后才分钟后才能正常工作能正常工作第42页/共141页第43页/共141页通道通道吸光度吸光度灯开灯开/关关波长波长灵敏度灵敏度下一画面下一画面运行时间运行时间(分分)自控自控/遥控遥控诊断开诊断开/关关键盘锁开键盘锁开/关关单单/双波长双波长Shift 开开/关关AUFS(Absorbance Unit Full Scale):满量程吸光度单位满量程吸光度单位第44页/共141页回车键回车键分屏显示键分屏显示键选项移动键选项移动键主屏幕主屏幕方法调

11、用，方法调用，A/B通道切换通道切换设置及诊断设置及诊断单单/双波长，双波长，自动调零自动调零运行运行/停止键停止键第二功能键第二功能键监视色谱图监视色谱图屏幕对比度屏幕对比度第45页/共141页Waters 2996 PDA 检测器检测器PDA(PhotoDiode Array):光电二极管矩阵光电二极管矩阵第46页/共141页只需设定如只需设定如下参数即可下参数即可采集数据采集数据波长范波长范围围分辨率分辨率每秒采每秒采集的光集的光谱数谱数操作极为简操作极为简便便不需费神选不需费神选择参比波长择参比波长及其带宽及其带宽第47页/共141页Waters 2414示差折光检测器示差折光检测器第

12、48页/共141页冲洗参比池冲洗参比池折射率折射率极性极性RIU量程量程检测器温度检测器温度下一画面下一画面运行时间运行时间(分分)自控自控/遥控遥控键盘锁开键盘锁开/关关模式模式Shift第49页/共141页回车键回车键屏幕对比度屏幕对比度选项移动键选项移动键主屏幕主屏幕方法调用，温度设置方法调用，温度设置自动调零自动调零运行运行/停止键停止键第二功能键第二功能键监视色谱图监视色谱图冲洗参比池冲洗参比池设置及诊断设置及诊断下一页下一页第50页/共141页第51页/共141页第52页/共141页Waters 2475荧光检测器荧光检测器第53页/共141页第54页/共141页发射发射/能量能量

13、灯开灯开/关关下一页下一页运行时间运行时间(分分)面板面板/软件控制软件控制键盘锁键盘锁/开开Shift开开/关关单单/多波长多波长通道选择通道选择增益增益波长波长诊断键开诊断键开/关关灵敏度灵敏度第55页/共141页回车键回车键分屏显示键分屏显示键选项移动键选项移动键主屏幕主屏幕方法调用，通道切换方法调用，通道切换设置诊断设置诊断自动调零自动调零运行运行/停止键停止键第二功能键第二功能键监视色谱图监视色谱图开关灯开关灯屏幕亮度调节屏幕亮度调节光谱扫描光谱扫描第56页/共141页第57页/共141页第58页/共141页MinutesColumn-Waters PAH Column,27 CEl

14、uent A:WaterEluent B:AcetonitrileGradient:60%B to 100%B usingcurve 9 in 12 minutesHold 11 minutesBack to initial conditionsFlow Rate 1.2 ml/minInjection:20ulTime programmedwavelength changes20.521.022.01000 MV脱气脱气未脱气未脱气Breeze with Fluorescence1231.Benzo(b)flouranthene 400 ppb2.Benzo(k)fluoranthene-2

15、00 ppb3.Benzo(a)pyrene-200 ppb第59页/共141页发射发射 激发激发 103 M105 M在庚烷中在庚烷中第60页/共141页第61页/共141页第62页/共141页反相色谱柱的选择反相色谱柱的选择第63页/共141页第64页/共141页第65页/共141页第66页/共141页注意注意：由于：由于硅羟基硅羟基的影响，许多情况下硅胶基质对的影响，许多情况下硅胶基质对 整个键合相的性能起决定作用整个键合相的性能起决定作用第67页/共141页Minutes04812162024YMC-Pack Pro C18YMC-Pack Pro C4二氢苊二氢苊萘萘对羟基苯甲酸丁酯

16、对羟基苯甲酸丁酯提示提示:相似的选择性归因于相同的硅相似的选择性归因于相同的硅 胶基质胶基质(同一品牌同一品牌,不同键合相不同键合相)第68页/共141页分分45678910YMC-Pack ODS-AQYMC-Pack Pro C18 酮洛芬酮洛芬痛灭定痛灭定萘普生萘普生舒洛芬舒洛芬舒洛芬舒洛芬 萘普生萘普生酮洛芬和痛灭定酮洛芬和痛灭定注意注意:由于硅胶颗粒基质不同由于硅胶颗粒基质不同(品牌不同品牌不同),分离的分离的选择性选择性不同不同第69页/共141页01020304050用于浸润固定相的甲醇水溶液的比例用于浸润固定相的甲醇水溶液的比例%020406080100在在1 mL/min流速

17、下的流速下的 浸润率浸润率%注意注意：需要有机溶剂来保证反相填料有合适的湿度需要有机溶剂来保证反相填料有合适的湿度,反之停流速后易出现反之停流速后易出现“疏水塌陷疏水塌陷”问题问题第70页/共141页未湿润的孔湿润的孔注意：注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱表面积会减少润，那么有效的色谱表面积会减少95%95%，因此，因此，减少被分析物减少被分析物的保留时间即等于的保留时间即等于“疏水塌陷疏水塌陷”，记住：记住：几乎所有的表面积几乎所有的表面积都在孔内都在孔内！低比例有机溶剂或低比例有机溶剂或纯水

18、溶液流动相纯水溶液流动相C18 硅胶硅胶第71页/共141页分分0246810流动相：流动相：0.1%醋酸水溶液醋酸水溶液阿莫西林阿莫西林Vo：被分析物没有保留：被分析物没有保留“湿润时湿润时”“去湿后去湿后”第72页/共141页停流速后停流速后(孔去湿孔去湿:3%)流动相：流动相：0.1%醋酸水溶液醋酸水溶液Minutes0246810 初始时初始时保留时间无变化保留时间无变化阿莫西林阿莫西林内嵌极性基团键合相：内嵌极性基团键合相：使用高比例水溶液流动相时色谱性能稳定使用高比例水溶液流动相时色谱性能稳定第73页/共141页 OSiCH3CH3PolarGroup内嵌极性基团配体OSiCH3C

19、H3传统直链烷基配体第74页/共141页SiCCCOCN(CH2)7CH3H3COOHCH3SiOOOOSiOOOOHH-极性基团增加了填料表层水的浓度极性基团增加了填料表层水的浓度降低碱性物质的保留降低碱性物质的保留减少了拖尾减少了拖尾改善与水的浸润性改善与水的浸润性屏蔽了带负屏蔽了带负电的硅羟基电的硅羟基第75页/共141页水水 “屏蔽屏蔽”层层降低了碱性化合物的保留降低了碱性化合物的保留降低了拖尾现象降低了拖尾现象屏蔽了带负屏蔽了带负电的硅羟基电的硅羟基CH3NH3CH+第76页/共141页SymmetryShield RP18Tf USP=1.1分分0102030阿米替林阿米替林Sym

20、metry C18Tf USP=1.9注意：对碱性化合物而言，可以减少保留时间并且改善色谱峰形注意：对碱性化合物而言，可以减少保留时间并且改善色谱峰形内置极性基团的配体与直链烷烃配体的比较内置极性基团的配体与直链烷烃配体的比较第77页/共141页注注:使用相同的流动相使用相同的流动相SymmetryShield RP8Symmetry C80102030-0.00200.0020.0040.0060.0080.010102030-0.00200.0020.0040.0060.0080.01minutesminutes呋喃唑酮呋喃唑酮(痢特灵痢特灵)杂质分析杂质分析第78页/共141页色谱柱选择

21、性比较表色谱柱选择性比较表(ln k 二氢苊二氢苊)Hypersil BDS C18Symmetry C18Inertsil ODS-2Inertsil ODS-3Kromasil C18YMC-Pack Pro C18YMC-Pack ODSAQNova-Pak C18Hypersil ODSYMC Jsphere ODSH80YMC Jsphere ODSM80Nucleosil C18Bondapak C18YMC Jsphere ODSL80Waters Spherisorb ODS1Resolve C18Waters Spherisorb ODS2-0.20.30.81.31.82.

22、32.811.522.533.5疏水性增加疏水性增加硅羟基活性降低硅羟基活性降低(ln a 阿米替林阿米替林/二氢苊二氢苊)选择性变化选择性变化第79页/共141页第80页/共141页USP 拖尾因子（拖尾因子（Tailing Factor）:Tf 不不对称因子对称因子(Assymmetry Factor):Asab峰高之峰高之5%处处abab)(a2+第81页/共141页第82页/共141页99.6%99.8%99.9%峰面积回收率峰面积回收率T=1.00Waters21,37992.3%95.3%97.8%T=1.58峰面积回收率峰面积回收率第83页/共141页 他莫昔芬他莫昔芬0.25

23、g/mL信噪比信噪比11.06.5AUSymmetry C18AU5.0010.00MinutesConventional C18第84页/共141页Rs=(t 峰峰 2 t峰峰 1)/0.5(w4.4%峰峰1+w4.4%峰峰2)=(11.5-10.6)/0.5(2.0+0.5)=0.72Minutes0510152025提示提示:基线分离的分离度基线分离的分离度 =1.5第85页/共141页1.二羟基丙酮二羟基丙酮2.心得安心得安(T=1.0)3.二氢苊二氢苊4.阿米替林阿米替林(T=1.6)1.二羟基丙酮二羟基丙酮2.心得安心得安(T=5.7)3.二氢苊二氢苊4.阿米替林阿米替林(T=7.

24、0)Alltima C8 Symmetry C8第86页/共141页第87页/共141页第88页/共141页第89页/共141页第90页/共141页第91页/共141页-0.20.30.81.31.82.32.811.522.533.54(l n k acenapht hene)(l n a am i t ri pt yl i ne/acenapht hene)Symmetry C18品牌 B品牌 C Symmetry C18 45 批批第92页/共141页紫杉醇中的不纯物分析紫杉醇中的不纯物分析:三批色谱柱所得色谱重叠图三批色谱柱所得色谱重叠图色谱柱色谱柱:Symmetry C8 3.5 m

25、(4.6 x 100 mm)8 流速流速:1.8 mL/min流动相流动相:甲醇甲醇/乙腈乙腈/水水 9:34:57检测波长检测波长:UV 230nm样品样品:25 L of 1 mg/mL 紫杉醇紫杉醇0.0010.0020.0030.00Minutes 第93页/共141页第94页/共141页第95页/共141页使用三官能团键合相可获得最佳使用三官能团键合相可获得最佳的稳定性的稳定性第96页/共141页Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane(MPEOS)Methyltriethoxysilane(MTEOS)杂化颗粒合成杂化颗粒合成(Hybrid p

26、article synthesis)同时含有有机和无机组分同时含有有机和无机组分拥有介于有机与无机材料拥有介于有机与无机材料 之间的性质之间的性质Xterra:Waters 创新的杂化填料创新的杂化填料第97页/共141页0102030400123456789101112pH硅羟基电离硅羟基电离硅羟基不电离硅羟基不电离 弱保留弱保留 好峰形好峰形 保留增加保留增加 好色谱峰形好色谱峰形 必须必须严格严格控制控制pH方可方可获得良好色谱重现性获得良好色谱重现性pH 10 去甲替林去甲替林阿米替林阿米替林Minutes0123Minutes0123pH 2 保留最强保留最强 好色谱峰形好色谱峰形

27、改善色谱重现改善色谱重现性性保留因子保留因子(k)碱性化合物在不同碱性化合物在不同pH条件下的分离度条件下的分离度第98页/共141页色谱柱色谱柱检检 测测:254 nm(相同进样量相同进样量)流动相流动相:50%乙腈乙腈/40%水水/10%含含 100 mM CAPSO,pH 10流动相流动相:30%乙腈乙腈/60%水水/10%含含100 mM 磷酸钠磷酸钠,pH 2.0MinutespH 100.000.2524681012酮康唑酮康唑阿司咪唑阿司咪唑0酮康唑酮康唑阿司咪唑阿司咪唑AUpH 2色谱图重叠色谱图重叠pH 2 与与10：阿司咪唑与：阿司咪唑与 酮康唑分析酮康唑分析第99页/共1

28、41页123456789101112pH中间中间 pH 硅胶柱硅胶柱低低 pH 硅胶柱硅胶柱高高 pH 聚合物基质柱聚合物基质柱宽宽 pH 范围范围 XTerra 填料色谱柱填料色谱柱XTerra色谱柱之宽色谱柱之宽pH范围范围(以一当三以一当三)第100页/共141页温度温度pH第101页/共141页Peak Number USP Tailing Factor1.多虑平1.22.去甲替林1.13.阿米替林1.14.三甲丙咪嗪1.0AU-0.0050.10Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00AU-0.020.48Minutes1.00

29、2.003.004.005.006.007.008.009.0010.001234123412341234AU0.000.26Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00AU-0.0050.10Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00第二十一天第二十一天第二天XTerra RP18普通硅胶普通硅胶C18 Conditions:Column:XTerra RP18,5 m,4.6 X 150 mmMobile Phase:40%pH 7,10 mM Na2PO4,60%ACNColumn

30、Temp.:60 CFlow Rate:1.5 mL/minDetector:254 nm三环抗抑郁药物分离三环抗抑郁药物分离第102页/共141页Waters Patent Technology2000 R&D 100 Award Winner第103页/共141页第104页/共141页第105页/共141页第106页/共141页12345109876V0=0.98 minTime(Min)1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.00ConditionsColumn:AtlantisTM 4.6 x 15

31、0 mm,5 mMobile Phase A:H2OMobile Phase B:ACNMobile Phase C:100 mM NH4COOH,pH 3.0Flow rate:2.0 mL/minGradient:Time Profile(min)%A%B%C0.00 80 10 1010.0 0 95 515.0 0 95 5Injection volume:5.0 LTemperature:30oCDetection:UV254 nmCompounds1.Uracil2.Acetanilide3.Triamcinolone4.Hydrocortisone 5.2-Amino-7-chl

32、oro-5-oxo-5H-1-benzopyrano-2,3-bpyridinecarbonitrile 6.6a-Methyl-17a-hydroxyprogesterone7.3-Aminofluoranthene8.2-Bromofluorene 9.Perylene10.Naphthol 2,3-apyrene第107页/共141页12345109876Time(Min)2.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.00V0=1.83 min化合物化合物:1.去甲肾上腺素去甲肾上腺素(NE)2.肾上腺素肾上腺素(E)3.3,4-二羟基苯基丙氨酸

33、二羟基苯基丙氨酸(DOPA)4.多巴胺多巴胺(DA)5.3-甲氧基甲氧基-4-羟基苯乙二醇羟基苯乙二醇(MHPG)6.4-羟基羟基-3-甲氧基苯基乙醇酸甲氧基苯基乙醇酸(VMA)7.5-羟色胺羟色胺(5-HT)8.3,4-二羟基苯乙酸二羟基苯乙酸(DOPAC)9.5-羟基羟基-3-吲哚乙酸吲哚乙酸(5HIAA)10.4-羟基羟基-3-甲氧基苯乙酸甲氧基苯乙酸(HVA)条件条件色谱柱色谱柱:4.6 x 150 mm,5 m 流动相流动相 A:H2O流动相流动相 B:ACN流动相流动相 C:100 mM NH4COOH,pH 3.0流速流速 1.0 mL/min梯度梯度:时间时间 流流动相组成动相

34、组成(min)%A%B%C0.00 90 0 105.00 90 0 1015.0 65 25 1020.0 65 25 10进样体积进样体积:10 L温度温度:30oC检测检测:UV280 nm第108页/共141页化合物化合物:USP拖尾因子拖尾因子1.L-抗坏血酸抗坏血酸(Vc)1.122.烟酸烟酸1.273.硫胺硫胺(VB1)1.204.吡哆醛吡哆醛1.135.VB61.046.叶酸叶酸1.107.咖啡因咖啡因1.108.核黄素核黄素(VB2)1.14Time(Min)1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.

35、0015.0012345876V0=1.37 min条件条件色谱柱色谱柱:4.6 x 150 mm,5 m 流动相流动相 A:0.1%TFA流动相流动相 B:乙腈乙腈流速流速:1.4 mL/min梯度梯度:时间时间 流动相组成流动相组成(min)%A%B 0.0100 0 4.0 97 3 6.0 85 15 15.0 80 20进样体积进样体积:10.0 L温度温度:30 oC检测检测:UV 260 nm第109页/共141页第110页/共141页第111页/共141页第112页/共141页C 1C 1C 4C 4C 6C 6C 8C 8C 18C 18PhenylPhenylC NC NN

36、 HN H2 2 BondaPakBondaPakResol veResol veN ova-PakN ova-PakD el t a-PakD el t a-PakSpheri sorbSpheri sorbSym m et rySym m et ryXt erraXt erraAt l ant i sAt l ant i s各种品牌的各种品牌的C18柱皆有各自不同的选择性柱皆有各自不同的选择性第113页/共141页第114页/共141页第115页/共141页第116页/共141页第117页/共141页第118页/共141页第119页/共141页第120页/共141页第121页/共141页N

37、RON1H2R3SiO NaSi-H1R23+-+RRRCl-+Na+Cl-+第122页/共141页B u ffe r p HT12342345678C o n v e n tio n a l C1 8M o d e rn C1 8Id e a l第123页/共141页第124页/共141页第125页/共141页nn保护柱脏保护柱脏,色谱柱被污染色谱柱被污染,分辨率下分辨率下降降第126页/共141页第127页/共141页第128页/共141页第129页/共141页第130页/共141页第131页/共141页第132页/共141页第133页/共141页HPLC常见问题分析常见问题分析第134页

38、/共141页第135页/共141页第136页/共141页第137页/共141页第138页/共141页判断故障与故障排除的原则判断故障与故障排除的原则规则一规则一确认问题至少发生两次以上。如果问题确认问题至少发生两次以上。如果问题 不重复出现，很难证实其确实为问题不重复出现，很难证实其确实为问题规则二规则二从最简单的因素入手从最简单的因素入手规则三规则三一次只变化一个因素，以使你能够确认一次只变化一个因素，以使你能够确认 所变因素与问题之间的关联所变因素与问题之间的关联第139页/共141页判断故障与故障排除的原则判断故障与故障排除的原则规则四规则四恢复原状。如果使用更换组件方法恢复原状。如果使用更换组件方法来来 查找问题之所在查找问题之所在,完毕后应将原有完完毕后应将原有完 好组件安装回原处。否则好组件安装回原处。否则,换下的组换下的组 件将来很难再利用件将来很难再利用,会造成浪费会造成浪费规则五规则五养成记录的好习惯。一个完整的好养成记录的好习惯。一个完整的好记记 录是成功地进行故障排除的关键录是成功地进行故障排除的关键第140页/共141页