半抗原免疫分析全面课件.ppt

1、半抗原免疫分析半抗原免疫分析ABCABC1内容内容?一、基本概念一、基本概念?抗原抗原?抗体抗体?二、免疫分析方法二、免疫分析方法?分类分类?ELISAELISA原理与方法原理与方法?方法建立方法建立-苏丹红为例苏丹红为例2抗原抗原3antigen,Agantigen,Ag一一)抗原的概念抗原的概念抗原抗原(Antigen,Ag(Antigen,Ag)是一类能是一类能刺激刺激机体免疫系机体免疫系统产生特异性免疫应答统产生特异性免疫应答,并能与相应的免疫应答并能与相应的免疫应答产物在体内或体外发生产物在体内或体外发生特异性结合特异性结合的物质的物质.4(二二)完全抗原与半抗原完全抗原与半抗原1.

2、1.完全抗原（完全抗原（complex antigen):complex antigen):既具免疫原性又有免疫反应性的物质既具免疫原性又有免疫反应性的物质.如如:大多数蛋白质大多数蛋白质.2.2.半抗原半抗原(hapten):(hapten):仅有免疫反应性而无免疫原性的物质仅有免疫反应性而无免疫原性的物质.如如:大多数多糖、类脂、某些药物大多数多糖、类脂、某些药物.半抗原半抗原+载体载体(蛋白质蛋白质)完全抗原完全抗原56共同抗原与交叉反应共同抗原与交叉反应共同抗原与交叉反应1.共同抗原(Common antigens)：存在于两种不同的抗原之间的相同或相似的抗原决定簇，称为共同抗原。2.

3、交叉反应(Cross-reaction)：由于存在共同抗原造成抗体对具有相同或相似决定簇的不同抗原发生反应，此称为交叉反应。检测意义：假阳性（避免）意义：假阳性（避免）多残留检测（利用）多残留检测（利用）89农药、兽药、生物毒素、重金属、维生素、防农药、兽药、生物毒素、重金属、维生素、防腐剂、植物激素等半抗原腐剂、植物激素等半抗原在食品安全、植物学、环境检测在食品安全、植物学、环境检测等领域，主要是半抗原类物质。等领域，主要是半抗原类物质。10抗体抗体antibody,Ab抗原与抗体是天生的一对，谁也离不了谁；抗原与抗体是天生的一对，谁也离不了谁；两者既是好朋友，又是一对冤家。两者既是好朋友，

4、又是一对冤家。一、基本概念一、基本概念1.1.抗体（抗体（AntibodyAntibody，AbAb）指指B B淋巴细胞受抗原刺激后活化、增殖、分淋巴细胞受抗原刺激后活化、增殖、分化成为浆细胞，产生的能与相应抗原发生特异化成为浆细胞，产生的能与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。性结合的免疫球蛋白。存在形式：存在形式：膜型膜型（membrane immunoglobulin,mIgmembrane immunoglobulin,mIg）B B细胞膜上的抗原受体；细胞膜上的抗原受体；分泌型分泌型(secreted immunoglobulin,sIg)(secreted immunoglobul

5、in,sIg)分泌进入体液分泌进入体液,介导体液免疫应答。介导体液免疫应答。二、免疫球蛋白的分子结构二、免疫球蛋白的分子结构（一）免疫球蛋白的基本结构：（一）免疫球蛋白的基本结构：由四条多肽链组成，呈由四条多肽链组成，呈“Y”“Y”或或“T”“T”型型1.1.组成：组成：?2 2条长链，又称重链（条长链，又称重链（Heavy chainHeavy chain，含含450-550aa450-550aa，分子量为，分子量为55-75KD55-75KD。?2 2条短链，又称轻链（条短链，又称轻链（Light chainLight chain，含含214aa214aa，分子量为，分子量为25KD25K

6、D。H H链）：链）：L L链）：链）：?2.2.分类、分型：分类、分型：（1 1）根据重链氨基酸组成、序列及结构的差异，将）根据重链氨基酸组成、序列及结构的差异，将Ig Ig 分为五类：分为五类：IgM(IgM()、IgG(IgG()、IgA(IgA()、IgD(IgD()、IgE(IgE()亚类亚类：IgGIgG：IgG1,IgG2,IgG3,IgG4 IgG1,IgG2,IgG3,IgG4 IgAIgA：IgA1,IgA2IgA1,IgA2IgM:IgM1,IgM2IgM:IgM1,IgM2?（2 2）分两型：）分两型：根据轻链氨基酸组成、序列及结构的差异，可将轻根据轻链氨基酸组成、序列

7、及结构的差异，可将轻链分为两型：链分为两型：和和型型?每一每一IgIg单体分子两条重链必须同类，两条轻链必须单体分子两条重链必须同类，两条轻链必须?同型。同型。抗体的制备方法抗体的制备方法?3.3.基因工程抗体基因工程抗体(GeAb):(GeAb):第三代抗体第三代抗体由基因重组技术制备的抗体由基因重组技术制备的抗体,称为基因工程抗称为基因工程抗体。体。?嵌合抗体嵌合抗体(chimeric Ab)?人源抗体（人源抗体（humanized Ab)?双特异性抗体（双特异性抗体（bispecific Ab)?Fab/ScFV（single chain FV fragment)单域抗体（单域抗体（si

8、ngle chain Ab)完美表演者。完美表演者。抗体的结构与功能的关系，抗体的结构与功能的关系，所展现出的生物学功能是其结构的所展现出的生物学功能是其结构的免疫分析技术免疫分析技术内内?容容分析方法分类分析方法分类?几种常用免疫分析技术几种常用免疫分析技术?ELISAELISA侧流免疫层析侧流免疫层析分析方法的建立分析方法的建立?分析数据的拟合分析数据的拟合?常用的免疫标记物质常用的免疫标记物质类别类别荧光素荧光素标记物标记物用途用途FITC、RB200、TRITC 免疫组化免疫组化镧系元素螯合物镧系元素螯合物放射性核素放射性核素免疫分析测定免疫分析测定3H、14C、32P、57Gr 免疫

9、分析测定免疫分析测定125I、131I酶酶HRP、AP 免疫组化免疫组化免疫分析测定免疫分析测定化学发光物化学发光物Luminol、lucigenin 免疫分析测定免疫分析测定金属颗粒金属颗粒胶体金、铁蛋白胶体金、铁蛋白免疫组化免疫组化免疫分析测定免疫分析测定一、标记免疫方法分类一、标记免疫方法分类1 1按标记物的种类分按标记物的种类分(1)(1)放射免疫分析放射免疫分析(radioimmunoassay(radioimmunoassay，RIA)RIA)(2)(2)酶免疫分析酶免疫分析(enzyme immunoassay(enzyme immunoassay，EIA)EIA)(3)(3)化

10、学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay(chemiluminescent enzyme immunoassay，(4)(4)荧光免疫分析法荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay(fluorescence immunoassay，FIA)FIA)2020/7/20。CIZIA)CIZIA)242按是否加入分离剂分(1)均相免疫分析(homogeneous lmmunoassay)在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，反应液中在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，反应液中结合的标记药物与游

11、离的标记药物之中有一种不产生信号或信结合的标记药物与游离的标记药物之中有一种不产生信号或信号消失，因此无需将反应液分作两相，即可在均相溶液中进行号消失，因此无需将反应液分作两相，即可在均相溶液中进行测定，故称为均相免疫分析。如酶放大免疫测定技术测定，故称为均相免疫分析。如酶放大免疫测定技术(enzyme(enzyme multiplied immunoassay techniquemultiplied immunoassay technique，EMIT)EMIT)。(2)非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay)在某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，只有在在

12、某些免疫分析中，当抗原一抗体反应达到平衡后，只有在反应液中加入分离剂，将游离标记药物和结合标记药物分开之反应液中加入分离剂，将游离标记药物和结合标记药物分开之后，才能测出各自部分的标记药物浓度。否则，测定的是两者后，才能测出各自部分的标记药物浓度。否则，测定的是两者的总浓度。由于这种信号的测定需将反应液分成液的总浓度。由于这种信号的测定需将反应液分成液-固两相后，固两相后，才能分别测定，故称为非均相免疫分析。如才能分别测定，故称为非均相免疫分析。如ELISA(Enzyme ELISA(Enzyme 2020/7/2025linked immunosorbent immunoassay)link

13、ed immunosorbent immunoassay)ELISAELISA简介简介（一）（一）ELISA技术的原理技术的原理间接法间接法夹心法夹心法竞争法竞争法夹心法夹心法Sandwich竞争法竞争法（二）（二）ELISA所用试剂材料所用试剂材料?1、固相?2、酶?3、底物?4、缓冲液?5、仪器1、固定相、固定相聚次亚乙烯聚次亚乙烯2、最常用的标记酶1辣根过氧化物酶(HRP):约有50的EIA使用此酶。2碱性磷酸酯酶(AP):AP标记的结合物性质稳定，其活性可用分光光度计或荧光计测量。36-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD):通常用于均相EIA。4-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(-Gal):适用于均

14、相EIA和非均相EIA。5苹果酸脱氢酶(MDH):多用于尿样的均相EIA。2020/7/20333、最常用的底物、最常用的底物?邻苯二酚(OPC)四甲基联苯胺(TMB)4、缓冲液、缓冲液?PBS(T)?Tris-HCl?Na3N是HRP（辣根过氧化物酶）的抑制剂4、仪器、仪器酶标仪酶标仪酶标仪酶标仪（三）（三）免疫分析方法建立免疫分析方法建立苏丹红为例苏丹红为例Step 1:Hapten and conjugateStep 2:characterization of conjugateStep 3:chessboard tiatrion and calibration curveStep 4:

15、optimizationnonessential例例1、标记抗原浓度对检测的影响、标记抗原浓度对检测的影响43例，例，pH影响影响Step 5:sample analysisStep 6:validation一个难点：基质效应一个难点：基质效应基质效应基质效应?基质基质：样品中除了目标分析物外还含有其他的：样品中除了目标分析物外还含有其他的物质，这些物质可能会对检测结果造成干扰，物质，这些物质可能会对检测结果造成干扰，这些干扰成分称为基质，其干扰称为基质效应这些干扰成分称为基质，其干扰称为基质效应(matrix effect)(matrix effect)（1 1）基质来源）基质来源?水、土壤的腐殖质水、土壤的腐殖质食品中的蛋白、脂肪等食品中的蛋白、脂肪等溶液中作为促溶的有机溶剂等溶液中作为促溶的有机溶剂等例例1：环境水样的基质效应：环境水样的基质效应49（2）基质干扰的消除）基质干扰的消除?掩蔽剂（缓冲液调整）掩蔽剂（缓冲液调整）?样品稀释样品稀释?样品前处理：净化样品前处理：净化50