制备型高效液相色谱课件.ppt

1、在生物制药中的应用在生物制药中的应用 基因工程药物基因工程药物:白细胞介素、胰岛素。白细胞介素、胰岛素。天然产物天然产物:蛋白质蛋白质,多肽多肽,多糖。多糖。第一节第一节 高效液相色谱法简介高效液相色谱法简介液相色谱的发展史液相色谱的发展史 19031903年，年，色谱法色谱法问世问世俄国植物学家茨维特俄国植物学家茨维特 1903 1903年年3 3月月2121日，大会报告日，大会报告 “一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”19061906年在德国植物学杂志发表文章，首次命名上年在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法

2、述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法 19311931年，库恩（年，库恩（KuhnKuhn）分离分离胡萝卜素胡萝卜素，19381938年，年，KuhnKuhn和和LedererLederer从维生素从维生素B B中分离出中分离出B B6 6，获得了获得了19381938年的诺贝尔化学奖。年的诺贝尔化学奖。19411941年，马丁（年，马丁（MartinMartin）和辛格（和辛格（SyngeSynge）提出提出液液分配色谱法液液分配色谱法，19521952年度的诺贝尔奖年度的诺贝尔奖。6060年代末，年代末，7070年代初，年代初，高效液相色谱仪高效液相色谱仪的成功研的成功研制制1.2 基本

3、仪器装置基本仪器装置 输液系统输液系统 进样系统进样系统 分离系统分离系统 检测系统检测系统 数据处理系统数据处理系统2.1 高效液相色谱高效液相色谱仪仪组成组成1 输液系统输液系统 (1)高压输液泵高压输液泵作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。高压输液泵高压输液泵在线脱气装置在线脱气装置(1)高压输液泵高压输液泵(2)在线脱气装置在线脱气装置作用：作用：脱去流动相中的溶解气体。流动相先经过脱气脱去流动相中的溶解气体。流动相先经过脱气

4、装置再输送到色谱柱。装置再输送到色谱柱。在线脱气、超声脱气、真空脱气等在线脱气、超声脱气、真空脱气等脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线飘移，噪音增加。基线飘移，噪音增加。Pressure Dampers O2,N2,CO2（3）梯度洗脱装置）梯度洗脱装置Isocratic elution恒定组成的单一溶剂体系恒定组成的单一溶剂体系Gradient elution以一定速度改变多种溶剂的配比淋洗，以一定速度改变多种溶剂的配比淋洗，目的是分离多组容量因子相差较大的组分目的是分离多组容量因子相差较大的组分High-Pressure Mixin

5、g2 进样系统进样系统六通阀六通阀3 色谱柱色谱柱Normal column 5-m、4.6-mNarrow bore column 1-3 mMicro column 1 m 色谱柱是实现分离的核心部件。要求柱效高、色谱柱是实现分离的核心部件。要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。填充质量和使用条件有关。色谱柱填料色谱柱填料spherical and irregular silica particles Macroporous spherical silica particle.K.K.Unger,Po

6、rous silica,Elsevier,1979 基质：基质：载体或担体。数载体或担体。数 m m数十数十 m m，球形。，球形。硅胶或有机高分子聚合物硅胶或有机高分子聚合物Pellicular particlePorous particle30-50m1-2m3-10 m 色谱柱填料色谱柱填料功能层：功能层：物理吸附或化学键物理吸附或化学键合合三、高效液相色谱法的特点三、高效液相色谱法的特点 采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检测器测器,从而实现了高效、高速、高灵敏度和定从而实现了高效、高速、高灵敏度和定量准确。量准确。和经典液相相比有以下和经典

7、液相相比有以下优点优点：快速、灵敏度高、：快速、灵敏度高、分辨率高、自动化程度高分辨率高、自动化程度高 等。等。四、制备型高效液相色谱与分析型四、制备型高效液相色谱与分析型高效液相色谱法的区别高效液相色谱法的区别 流速不同流速不同 检测池不同检测池不同 上样量不同上样量不同 色谱柱不同色谱柱不同五、色谱的基本理论及有关参数五、色谱的基本理论及有关参数 两大理论：两大理论：塔板理论塔板理论(the plate model):阐明了色谱、蒸馏和萃阐明了色谱、蒸馏和萃取之间的相似性，将色谱柱设想成由许多液液萃取之间的相似性，将色谱柱设想成由许多液液萃取单元或理论塔板组成；相似于精馏过程，色谱取单元或

8、理论塔板组成；相似于精馏过程，色谱分离也是一个分配平衡过程分离也是一个分配平衡过程.N=16(tR/wb)2 N=5.54(tR/w1/2)2 速率理论速率理论:研究各种动力学因素对峰展宽的影响。研究各种动力学因素对峰展宽的影响。H=A+Cu有关参数有关参数 分离度：在色谱过程中表示两组分相互分离的程度分离度：在色谱过程中表示两组分相互分离的程度,一般情况下一般情况下,分离度大于分离度大于1.51.5时称分离完全时称分离完全.只有峰窄而间距大的分离是令人满意的。只有峰窄而间距大的分离是令人满意的。在色谱分析中要求：在色谱分析中要求：两组分的保留值差别要足够大。两组分的保留值差别要足够大。两色谱

9、峰要足够窄。两色谱峰要足够窄。待测组分的分离度要足够大，分离过程要尽可能短待测组分的分离度要足够大，分离过程要尽可能短.2121)(2)(211212WWttWWttRrrrr 容量因子容量因子：溶质在固定相中的总摩尔数与：溶质在固定相中的总摩尔数与流动相中总摩尔数之比。流动相中总摩尔数之比。选择因子选择因子：两组分容量因子的比值：两组分容量因子的比值 容量因子、选择因子、理论塔板数对分离容量因子、选择因子、理论塔板数对分离度的影响度的影响00tttkR12kk2122)1)(1(41NkkR六、制备型高效液相色谱的重要参数六、制备型高效液相色谱的重要参数CapacityCapacity:纯化

10、过程中，目标物质的上样量。可以纯化过程中，目标物质的上样量。可以是体积也可以是质量。是体积也可以是质量。SpeedSpeed:在除去蛋白酶的过程中此项非常关键。在除去蛋白酶的过程中此项非常关键。RecoveryRecovery:产品贵重时此项很重要。流动相的条件、产品贵重时此项很重要。流动相的条件、环境会影响它。减少步鄹和保持一种对生物样品环境会影响它。减少步鄹和保持一种对生物样品合适的环境条件。合适的环境条件。ResolutionResolution:在纯化的最后阶段，此项很关键，尤在纯化的最后阶段，此项很关键，尤其是杂质的结构和目的物结构相似时。其是杂质的结构和目的物结构相似时。七、分离机

11、理和色谱类型七、分离机理和色谱类型 分离蛋白质类物质时的分离依据分离蛋白质类物质时的分离依据：疏水性疏水性分子大小分子大小等电点等电点结构特异性结构特异性色谱介质按分离机理分为色谱介质按分离机理分为正相色谱正相色谱反相色谱反相色谱：常加入：常加入TFA离子交换色谱离子交换色谱：阴离子交换色谱（：阴离子交换色谱（DEAE二乙基二乙基氨基乙基，氨基乙基，Q季胺盐）阳离子交换色谱（季胺盐）阳离子交换色谱（CM羧甲基羧甲基S磺酸基）磺酸基）凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱疏水色谱疏水色谱：苯基，辛基等。：苯基，辛基等。金属螯合色谱金属螯合色谱：镍、铜等：镍、铜等亲合色谱亲合色谱 第二节第二节 分离方案的设计分

12、离方案的设计 What is the intended use of the product?What kind of starting material is available and how should it be handled?What are the purity issues in relation to the source material and intended use of the final product?What has to be removed?What must be removed completely?What will be the final sc

13、ale of puridication?What are the economical constraints and what resources and equipment are available?一、分离方法之间的组合一、分离方法之间的组合 四步纯化法：四步纯化法：Preparation:Capture:(Isolate,concentrate and stabilize)Intermediate purification:(Remove bulk impurities)Polishing:(Achieve final high level purity)色谱之间的色谱之间的组合方案

14、组合方案 AC、GF、IEX、HIC二、分离条件的优化二、分离条件的优化 合适的溶剂强度合适的溶剂强度:容量因子容量因子k 足够的足够的柱效柱效N:良好的良好的分离选择性分离选择性:当当柱过载柱过载时：时：1 N1 N和和k都随样品负荷的增加而迅速地减小都随样品负荷的增加而迅速地减小2 2 流速对于塔板数流速对于塔板数N的影响大大地降低的影响大大地降低 3 通过增加柱长来有效地提高柱效，不宜通过增加柱长来有效地提高柱效，不宜通过降低柱压（或流速）来达此目的通过降低柱压（或流速）来达此目的 制备分离的制备分离的两种途径两种途径：第一种，基本上同于分析型，进样量第一种，基本上同于分析型，进样量不过

15、载不过载，利用大内径的柱，通过调整分离方程中的有关利用大内径的柱，通过调整分离方程中的有关参数来达到分离的最佳化。在该法中往往利用参数来达到分离的最佳化。在该法中往往利用小颗粒的填料（约小颗粒的填料（约10m）来制取少量价值高来制取少量价值高而难分离的物质。而难分离的物质。第二种，使用大粒度填料（第二种，使用大粒度填料（50m）的大内的大内径柱，在径柱，在过载过载情况下制备相对大量的纯物质。情况下制备相对大量的纯物质。当当值相当大时（例如值相当大时（例如1.2），提高洗脱液的），提高洗脱液的流速并不至于严重降低分离度，从而大大缩短流速并不至于严重降低分离度，从而大大缩短分离时间。分离时间。三、

16、制备型高效液相色谱常见问题及三、制备型高效液相色谱常见问题及解决办法解决办法 待分离成分呈单一主峰待分离成分呈单一主峰 不易分开的两组分不易分开的两组分 目的组分含量少目的组分含量少 待分离成分呈单一主峰待分离成分呈单一主峰 不易分开的两组分不易分开的两组分 目的组分含量少目的组分含量少第三节第三节 实验条件的选择实验条件的选择 色谱柱的选择与填装色谱柱的选择与填装 柱填料柱填料 流动相选择流动相选择 检测器的选择检测器的选择 仪器设备仪器设备一、柱的选择和装填 柱：柱：不锈钢柱不锈钢柱：200kg，生物适应性差生物适应性差 玻璃柱：玻璃柱：1015kg 聚合物柱：聚合物柱：装填：装填：当粒度

17、小于当粒度小于20m，用较大的匀浆罐湿法填装。，用较大的匀浆罐湿法填装。粒度大于粒度大于30m时；利用轻敲柱外壁的干填法时；利用轻敲柱外壁的干填法二、柱填料 硅胶：硅胶：葡聚糖和琼脂糖：葡聚糖和琼脂糖：高分子聚合物：高分子聚合物：颗粒大小 在在很小很小的分离制备中，要求较高的的分离制备中，要求较高的N N值，宜值，宜用小粒度的填装柱。用小粒度的填装柱。当当很大很大时，用大颗粒填装柱，对过载进样是时，用大颗粒填装柱，对过载进样是有好处。有好处。三、洗脱剂 可可利用相同填料的分析柱利用相同填料的分析柱，选择最适合于分离，选择最适合于分离目的和要求的流动相的组成（如溶剂的配比，目的和要求的流动相的组

18、成（如溶剂的配比，离子强度，离子强度，pHpH等），将其直接或略加修改后用等），将其直接或略加修改后用于制备分离于制备分离 一般一般不采用梯度洗脱不采用梯度洗脱 选择合适的溶剂选择合适的溶剂溶解样品溶解样品 采用色谱纯的试剂采用色谱纯的试剂四、仪器设备 对泵的精密度和准确度要求不高（对泵的精密度和准确度要求不高（0.010.01100100mLmL/min/min）对检测器的高灵敏要求不高对检测器的高灵敏要求不高 流路系统流路系统尽可能用尽可能用惰性聚合材料惰性聚合材料 柱外效应柱外效应试验结果试验结果影响较小影响较小 第四节第四节 操作变量的确定操作变量的确定 一、样品的进样量一、样品的进样

19、量 宜注射宜注射低浓度大体积低浓度大体积的样品，不宜注射高浓度的样品，不宜注射高浓度小体积的样品。小体积的样品。样品进样的体积与柱的内径、柱长、流动相和样品进样的体积与柱的内径、柱长、流动相和固定相的类型、样品的溶解性以及分离目的有固定相的类型、样品的溶解性以及分离目的有关。关。二、制备产率 产率随分离度的提高而增加。产率随分离度的提高而增加。不过载的柱子，不过载的柱子，k k值较小时，产率较高。值较小时，产率较高。用全孔填料时产率高于用薄壳型的。用全孔填料时产率高于用薄壳型的。对于对于值小的分离，宜利用小粒度（值小的分离，宜利用小粒度（5 51010mm）填料的柱子；在填料的柱子；在较大时，

20、使用较大颗粒、大内径较大时，使用较大颗粒、大内径的柱，将获得较高的产率，且价格便宜。的柱，将获得较高的产率，且价格便宜。柱的样品容量和产率随柱横截面积的增加而增大。柱的样品容量和产率随柱横截面积的增加而增大。产率随柱长、流动相的流速的增加而增加。产率随柱长、流动相的流速的增加而增加。三、回收率计算和纯度鉴定 除去组分中的溶剂：热的氮气流吹，真空旋转除去组分中的溶剂：热的氮气流吹，真空旋转蒸发，冷冻干燥。蒸发，冷冻干燥。纯度：纯度：HPLCHPLC，TCLTCL。回收率：重量，活性。回收率：重量，活性。蛇毒中溶栓组分的分离蛇毒中溶栓组分的分离制备型高效液相色谱的应用制备型高效液相色谱的应用 肽的

21、分离肽的分离 蛋白质的分离蛋白质的分离 多糖的分离多糖的分离 核酸的分离核酸的分离 肽的分离：肽的分离：常用方法为反相色谱和离子交换色谱常用方法为反相色谱和离子交换色谱 肽的保留时间可用氨基酸的保留常数之和预测。肽的保留时间可用氨基酸的保留常数之和预测。反相色谱分为：缓冲液反相色谱，离子对反相反相色谱分为：缓冲液反相色谱，离子对反相色谱。色谱。肽的检测：肽的检测：UV200UV200230nm230nm，荧光检测。荧光检测。蛋白质的分离蛋白质的分离1 1填料填料：孔径孔径3003005005002 2流动相流动相（1 1）pH pH 低低pHpH使蛋白质羧基解离受到抑制，使蛋白质羧基解离受到抑

22、制，极性降低，与反相键合相的作用强。对大极性降低，与反相键合相的作用强。对大多蛋白质而言，使用多蛋白质而言，使用pH2.5pH2.53.53.5的流动相的流动相可以得到最好的分离。可以得到最好的分离。（2 2）离子强度和离子对试剂离子强度和离子对试剂 增加离子强度增加了蛋白质与键合相的疏水作增加离子强度增加了蛋白质与键合相的疏水作用，较高的离子强度（用，较高的离子强度（0.20.2）可使蛋白质有较好）可使蛋白质有较好的分辨率和回收率。的分辨率和回收率。缓冲液中的盐还能通过形成离子对改变蛋白缓冲液中的盐还能通过形成离子对改变蛋白质分子表面极性。反离子是疏水的（如三氟乙酸质分子表面极性。反离子是疏

23、水的（如三氟乙酸根、七氟丁酸根），复合离子对保留时间增长。根、七氟丁酸根），复合离子对保留时间增长。如果反离子是亲水的（如磷酸根、甲酸根），则如果反离子是亲水的（如磷酸根、甲酸根），则复合离子对保留时间减少。复合离子对保留时间减少。（3 3）有机溶剂有机溶剂 有机溶剂的选择是改变蛋白质保留性的重要手有机溶剂的选择是改变蛋白质保留性的重要手段之一。较常用的有乙腈和丙醇。段之一。较常用的有乙腈和丙醇。使用复合溶剂（如异丙醇使用复合溶剂（如异丙醇-乙醇、乙腈乙醇、乙腈-异丙醇异丙醇等）可降低有机溶剂总浓度并改善分辨率及回等）可降低有机溶剂总浓度并改善分辨率及回收率。收率。（4 4）表面活性剂表面活性

24、剂 两性离子表面活性剂可以两性离子表面活性剂可以减少高分子量、疏水性较强的蛋白质的拖尾，减少高分子量、疏水性较强的蛋白质的拖尾，使分离得以改善。使分离得以改善。（5 5）温度温度 为了防止蛋白质的不可逆变性和为了防止蛋白质的不可逆变性和失活，分离一般在室温或低温下进行失活，分离一般在室温或低温下进行。三、多糖的分离三、多糖的分离 分离分离：高效体积排阻色谱：高效体积排阻色谱 检测检测：常用示差折射仪（：常用示差折射仪（RIRI）示差折射检测器示差折射检测器 通过连续监测参比池和测量池中溶液的折通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定溶质浓度。由于折射率是物质射率之差来测定溶质浓度。由

25、于折射率是物质的通用性质，示差折射检测器是一种通用型的的通用性质，示差折射检测器是一种通用型的整体性质检测器整体性质检测器 凡是与流动相光折射率有差别的样品都可凡是与流动相光折射率有差别的样品都可用它来测定，其检测限可达（用它来测定，其检测限可达（10-610-7）g/mL。由于折射率对温度的变化非常灵敏，大多数溶由于折射率对温度的变化非常灵敏，大多数溶剂折射率的温度系数越为剂折射率的温度系数越为510-4，因此，检测，因此，检测器必须恒温，才能获得精确的结果。折射检测器必须恒温，才能获得精确的结果。折射检测器的灵敏度较低，不能用于梯度洗脱。器的灵敏度较低，不能用于梯度洗脱。四、四、核酸与核苷酸核酸与核苷酸的分离的分离五、五、脂类脂类的分离的分离