第十三章-血栓与止血检验课件.ppt

1、第十三章第十三章 血栓与止血检验血栓与止血检验编辑制作 熊石龙一、基本理论一、基本理论n 血管壁的正常结构包括三层：内层、中层和外层血管壁的正常结构包括三层：内层、中层和外层内层：内皮细胞内层：内皮细胞+基底膜基底膜 内皮细胞管壁有肝素类物质内皮细胞管壁有肝素类物质 内皮细胞内含细胞器内皮细胞内含细胞器 （棒状小体（棒状小体 vWFvWF和和t-PAt-PA，TMTM，AT-,PAI-1AT-,PAI-1等等）中层：平滑肌细胞（脉细血管无此层）中层：平滑肌细胞（脉细血管无此层）外层：结缔组织外层：结缔组织血管壁的结构血管壁的结构第十三章第十三章 第一节第一节 血管壁的止血作用及检验血管壁的止血

2、作用及检验激活血激活血小板小板激活凝激活凝血过程血过程抗血抗血栓特栓特性性收缩收缩反应反应血管壁的止血功能血管壁的止血功能第十三章第十三章 第一节第一节 血管壁的止血作用及检验血管壁的止血作用及检验一、基本理论一、基本理论血小板的止血功能血小板的止血功能第十三章第十三章 第一节第一节 血管壁的止血作用及检验血管壁的止血作用及检验 血管损伤（抗血栓特性降低）血管损伤（抗血栓特性降低）血管收缩血管收缩 激活凝血过程激活凝血过程 血流减慢血流减慢 纤维蛋白形成纤维蛋白形成 血管内皮下成分暴露血管内皮下成分暴露 血小板黏附、聚集、释放血小板黏附、聚集、释放 血栓形成血栓形成血浆血管性血友病因子抗原血浆

3、血管性血友病因子抗原vWF:AgvWF:Ag，ELISAELISA法法原理纯化的兔抗人原理纯化的兔抗人vWF:AgvWF:Ag抗体包被聚苯乙烯反应板，加入抗体包被聚苯乙烯反应板，加入稀释的待测血浆，样本中的稀释的待测血浆，样本中的vWF:AgvWF:Ag结合于固相的抗体结合于固相的抗体上，然后加入酶标记兔抗人上，然后加入酶标记兔抗人vWF:AgvWF:Ag抗体，与其定量结抗体，与其定量结合，洗去多余抗体后，加底物显色，通过查找标准曲合，洗去多余抗体后，加底物显色，通过查找标准曲线，即可计算出线，即可计算出vWF:AgvWF:Ag的含量。的含量。第十三章第十三章 第一节第一节 血管壁的止血作用及

4、检验血管壁的止血作用及检验二、血管壁（内皮）检验二、血管壁（内皮）检验 vWF:AgvWF:Ag 操作操作n单抗以单抗以0.1mol/L0.1mol/L的碳酸盐缓冲液（的碳酸盐缓冲液（pH9.5pH9.5）稀释成）稀释成10g/ml10g/ml加入反应板中，每孔加入反应板中，每孔0.2ml0.2ml，置于湿盒中，置于湿盒中44过夜。过夜。n0.05%Tween0.05%Tween2020，0.01mol/L0.01mol/L磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（pH7.4pH7.4，TweenTweenPBSPBS）洗）洗3 3次后加入用次后加入用0.4%BSA0.4%BSAPBSPBS稀释的待稀释的待

5、测血浆或培养液上清，每孔测血浆或培养液上清，每孔0.2ml0.2ml，3737温育温育2 2小时。小时。n同前洗涤同前洗涤3 3次后，加入用同上缓冲液稀释的酶标次后，加入用同上缓冲液稀释的酶标vWFvWF单单抗，每孔抗，每孔0.2ml0.2ml，3737温育温育2 2小时。小时。第十三章第十三章 第一节第一节 血管壁的止血作用及检验血管壁的止血作用及检验 vWF:AgvWF:Ag 操作操作n同前洗涤同前洗涤5 5次后，每孔加底物溶液（次后，每孔加底物溶液（OPD 1mg/mlOPD 1mg/ml，用，用0.1ml/L0.1ml/L，pH4.5pH4.5的枸橼酸盐缓冲液配制，的枸橼酸盐缓冲液配制

6、，30%30%过氧化过氧化氢氢0.5g/ml0.5g/ml）0.2ml0.2ml，置室温约，置室温约5 5分钟后，各孔加分钟后，各孔加3mol/L3mol/L硫酸硫酸0.05ml0.05ml终止反应。终止反应。n室温放置室温放置10min10min后在酶标仪上测定后在酶标仪上测定492nm492nm处的吸光度值。处的吸光度值。n 绘制标准曲线绘制标准曲线 正常混合血浆以正常混合血浆以0.4%BSA0.4%BSAPBAPBA按按1 1：2020、1 1：5050、1 1：100100、1 1：200200、1 1：500500、1 1：10001000六种六种浓度稀释，与待测样品在相同条件下测定

7、。浓度稀释，与待测样品在相同条件下测定。第十三章第十三章 第一节第一节 血管壁的止血作用及检验血管壁的止血作用及检验参考值：参考值：61.6%61.6%126.6%126.6%注意事项注意事项对血浆对血浆vWFvWF：AgAg浓度过高的标本，应稀释后再测定。浓度过高的标本，应稀释后再测定。所有所有ELISAELISA测定中应注意的事项均应引起重视。测定中应注意的事项均应引起重视。除本方法外，也可以采用胶乳增强免疫比浊法。除本方法外，也可以采用胶乳增强免疫比浊法。第十三章第十三章 第一节第一节 血管壁的止血作用及检验血管壁的止血作用及检验 vWF:AgvWF:Ag 参考区间参考区间 vWF:Ag

8、vWF:Ag 应用评价应用评价血管性血友病因子抗原测定主要用于血管性血友病的诊断和鉴别诊断血管性血友病因子抗原测定主要用于血管性血友病的诊断和鉴别诊断 1.1.减低减低 见于血管性血友病（见于血管性血友病（vWDvWD），是诊断），是诊断vWDvWD及其分型的重要依据及其分型的重要依据2.2.升高升高 见于血栓性疾病，如急性冠脉综合征（见于血栓性疾病，如急性冠脉综合征（ASCASC）、心肌梗死、）、心肌梗死、脑血管病变、妊娠高血压综合征、肾小球疾病等，同时也见脑血管病变、妊娠高血压综合征、肾小球疾病等，同时也见 于剧烈运动后，肾上腺素受体被兴奋等。于剧烈运动后，肾上腺素受体被兴奋等。应用评价以

9、前应用评价以前vWFvWF：AgAg定量常采用免疫火箭电泳，由于操作较为复杂，现定量常采用免疫火箭电泳，由于操作较为复杂，现在少用。在少用。ELISAELISA常用于定量检测常用于定量检测vWFvWF：AgAg，但是胶乳增强的免疫比浊，但是胶乳增强的免疫比浊法更为简便快速，而且可以在全自动血凝仪上进行测定。法更为简便快速，而且可以在全自动血凝仪上进行测定。第十三章第十三章 第一节第一节 血管壁的止血作用及检验血管壁的止血作用及检验 凝血酶调节蛋白，凝血酶调节蛋白，TM 原理将抗人凝血酶调节蛋白（原理将抗人凝血酶调节蛋白（Thrombomdulin,TMThrombomdulin,TM）单克隆抗

10、体包被于聚苯乙烯放免小杯中，样本中的单克隆抗体包被于聚苯乙烯放免小杯中，样本中的TMTM结合于包被的放免小杯上，加入结合于包被的放免小杯上，加入125I-125I-抗人抗人TMTM单抗，根单抗，根据结合的据结合的125I125I放射性强度计算出样品中放射性强度计算出样品中TMTM的含量。的含量。第十三章第十三章 第一节第一节 血管壁的止血作用及检验血管壁的止血作用及检验 TM TM 操作操作1.绘制校正曲线绘制校正曲线 人人TM标准品用缓冲液标准品用缓冲液A做倍比稀释，做倍比稀释，TM的浓度分别的浓度分别为为500，250，125，31.25，15.6，7.3,3.9和和0ng/ml,以人以人

11、TM浓度浓度为横坐标，以为横坐标，以cpm为纵坐标绘制校正曲线。为纵坐标绘制校正曲线。2.将将200l的抗人的抗人TM单抗包被液加入聚苯乙烯放免小杯中，单抗包被液加入聚苯乙烯放免小杯中，4过夜，过夜，用洗涤液用洗涤液A洗洗3次，将待测样本（或标准品）次，将待测样本（或标准品）0.25ml与等量缓冲液与等量缓冲液A混合，每小杯加入混合，每小杯加入20l稀释样品液（空白管加入缓冲液稀释样品液（空白管加入缓冲液A），），37水浴水浴2h，用洗涤液，用洗涤液A洗洗3次，加入次，加入200l125I-抗人抗人TM单抗，单抗，37水水浴浴2h，再用洗涤液，再用洗涤液B洗六次，在洗六次，在闪烁测定仪上测定放

12、射活性，在闪烁测定仪上测定放射活性，在校正曲线上查出相应的浓度。校正曲线上查出相应的浓度。TM 参考区间参考区间 2552g/L第十三章第十三章 第一节第一节 血管壁的止血作用及检验血管壁的止血作用及检验 TM TM是由血管内皮细胞合成和分泌释放的，它表达于血管内皮细胞是由血管内皮细胞合成和分泌释放的，它表达于血管内皮细胞表面，和循环血液中的凝血酶形成表面，和循环血液中的凝血酶形成1 1：1 1的的TM-TM-凝血酶复合物，此复合凝血酶复合物，此复合物将蛋白物将蛋白C C（PCPC）激活为活化蛋白）激活为活化蛋白C C（APCAPC），），APCAPC有灭活有灭活FaFa、FaFa和和激活纤溶

13、活性的作用，因此激活纤溶活性的作用，因此TMTM对于血管的抗凝作用十分重要。正常情对于血管的抗凝作用十分重要。正常情况下，血浆中况下，血浆中TMTM的含量很低，但当血管内皮受损后，血浆中的的含量很低，但当血管内皮受损后，血浆中的TMTM含量含量明显升高且与内皮的损伤程度相关。目前认为，明显升高且与内皮的损伤程度相关。目前认为，TM:AgTM:Ag的检测是了解的检测是了解血管内皮损伤最好的指标。血管内皮损伤最好的指标。TM:AgTM:Ag的水平升高的水平升高 见于血栓性疾病，如糖尿病、心肌梗死、脑血见于血栓性疾病，如糖尿病、心肌梗死、脑血栓、深静脉血栓形成（栓、深静脉血栓形成（DVTDVT）、）

14、、DICDIC等。等。第十三章第十三章 第一节第一节 血管壁的止血作用及检验血管壁的止血作用及检验 TM TM 应用评价应用评价TM TM 注意事项注意事项 1.1.如果样品不能当天测定，应在采血后立即将血浆分离如果样品不能当天测定，应在采血后立即将血浆分离出放于出放于-20-20冷冻保存。冷冻的样品复溶时应在冷冻保存。冷冻的样品复溶时应在3737水浴中进行，室温中缓慢解冻则可导致水浴中进行，室温中缓慢解冻则可导致TMTM沉淀。沉淀。2.2.若样本中的若样本中的TMTM含量超过校正曲线范围应适量稀释后含量超过校正曲线范围应适量稀释后再次测定再次测定。第十三章第十三章 第一节第一节 血管壁的止血

15、作用及检验血管壁的止血作用及检验血浆血浆6-酮酮-前列腺素前列腺素F1检测检测 原理原理 ELISA ELISA法：将抗原（血浆法：将抗原（血浆6-6-酮酮-前列腺素前列腺素F1-F1-牛血清白蛋白连接物）包被于固相载体上，与游离抗牛血清白蛋白连接物）包被于固相载体上，与游离抗原（待测样品或原（待测样品或6-6-酮酮-前列腺素前列腺素F1F1标准品）竞争性地标准品）竞争性地与一定量的抗与一定量的抗6-6-酮酮-PGF1-PGF1抗体结合，洗涤后加入过量抗体结合，洗涤后加入过量的酶标记第二抗体，再加入底物显色。待检血浆或标的酶标记第二抗体，再加入底物显色。待检血浆或标准品中的准品中的6-6-酮酮

16、-PGF1-PGF1含量与显色程度呈负相关，根据含量与显色程度呈负相关，根据显色程度（显色程度（A A值）即可从标准曲线中推算出待检血浆中值）即可从标准曲线中推算出待检血浆中6-6-酮酮-PGF1-PGF1的含量。的含量。第十三章第十三章 第一节第一节 血管壁的止血作用及检验血管壁的止血作用及检验血浆血浆6-6-酮酮-前列腺素前列腺素F1F1检测检测 操作步骤操作步骤1.1.标本采集标本采集 顺利采取静脉血后与顺利采取静脉血后与5%EDTA-Na25%EDTA-Na2进行进行9 9：1 1抗凝混抗凝混匀，匀，3000r/min3000r/min离心离心20min20min分离出血浆。分离出血浆

17、。2.2.用碳酸盐缓冲液将用碳酸盐缓冲液将6-6-酮酮-PGF1-BSA-PGF1-BSA作一定稀释后包被于酶作一定稀释后包被于酶标反应板，再用标反应板，再用0.3%0.3%明胶封闭。加入标准品（倍比稀释成明胶封闭。加入标准品（倍比稀释成12.51600pg/ml 12.51600pg/ml 浓度）或待测样品、兔抗浓度）或待测样品、兔抗6 6酮酮-PGF1IgG100lPGF1IgG100l后在后在3737中温育中温育2h2h。洗涤后再加入酶标。洗涤后再加入酶标第二抗体第二抗体200l200l在在3737反应反应2h2h。以。以OPD-OPD-过氧化氢为基质显过氧化氢为基质显色色20min20

18、min，加入，加入3mol/L3mol/L硫酸中止反应，在酶标检测仪上测硫酸中止反应，在酶标检测仪上测定定490nm490nm处的吸光度值处的吸光度值A A。第十三章第十三章 第一节第一节 血管壁的止血作用及检验血管壁的止血作用及检验血浆血浆6-6-酮酮-前列腺素前列腺素F1F1检测检测 参考区间参考区间标准曲线与计算标准曲线与计算式中式中:B:B为测定管；为测定管；B0B0为不加样品管，最大结合率管；为不加样品管，最大结合率管；B/B0B/B0为结合率。为结合率。以标准品含量为横坐标，以标准品含量为横坐标，B/B0B/B0（%）为纵坐标，在半对）为纵坐标，在半对数纸上绘制出标准曲线。根据样品

19、孔数纸上绘制出标准曲线。根据样品孔B/B0B/B0（%）值在标）值在标准曲线上读出准曲线上读出6-6-酮酮-PGF1-PGF1的含量。的含量。样品样品6-6-酮酮-PGF1-PGF1浓度（浓度（pg/mlpg/ml）=测定值测定值1010。参考范围参考范围10.710.725.1 pg/ml25.1 pg/ml。第十三章第十三章 第一节第一节 血管壁的止血作用及检验血管壁的止血作用及检验100%AAAAB/B0(%)非特异零标准孔非特异标准品或样品血浆血浆6-6-酮酮-前列腺素前列腺素F1F1检测检测 应用评价应用评价 血浆血浆6-6-酮酮-前列腺素前列腺素F1F1是血管内皮细胞膜上是血管内皮

20、细胞膜上PGG2PGG2和和PGH2PGH2代谢的终末产物，检测血浆中代谢的终末产物，检测血浆中6-6-酮酮-前列腺素前列腺素F1F1的水平能客观的反映血管内皮的功能，有助于对的水平能客观的反映血管内皮的功能，有助于对血管内皮损伤程度的了解和疗效评价。血管内皮损伤程度的了解和疗效评价。血浆血浆6-6-酮酮-前列腺素前列腺素F1F1减低减低 见于血栓性疾病，见于血栓性疾病，如急性心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、动脉粥样硬如急性心肌梗死、心绞痛、脑血管病变、动脉粥样硬化、周围血管血栓形成及血栓性血小板减少性紫癜等。化、周围血管血栓形成及血栓性血小板减少性紫癜等。第十三章第十三章 第一节第一节 血管壁

21、的止血作用及检验血管壁的止血作用及检验n 了解血小板的超微结构，在此基础上理解血小板了解血小板的超微结构，在此基础上理解血小板的止血功能。的止血功能。n 理解并掌握血小板止血功能实验室检查的临床应理解并掌握血小板止血功能实验室检查的临床应用及评价。用及评价。学习要点学习要点第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验一、基本理论一、基本理论n 血小板（血小板（blood plateletblood platelet）由骨髓中成熟巨核细胞的）由骨髓中成熟巨核细胞的胞胞 质分割生成，是哺乳动物血液中体积最小的血细胞。

22、质分割生成，是哺乳动物血液中体积最小的血细胞。n 血小板数量：血小板数量：(100(100300)x10300)x109 9个个/L/L（成年人）。（成年人）。n 血小板寿命：血小板寿命：7 71010天。天。n 主要功能：促进止血和加速凝血，在止血、伤口愈主要功能：促进止血和加速凝血，在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中起重要作用。过程中起重要作用。血小板概述血小板概述第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验 血小板结构血小板结构第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验

23、血小板止血作用及检验n 光学显微镜：一般表现为多形态，光学显微镜：一般表现为多形态，直径直径1 14m4m，具有运动和变形能力。，具有运动和变形能力。瑞氏染色后见血小板胞质呈灰蓝色瑞氏染色后见血小板胞质呈灰蓝色或淡红色，无胞核，中心部位有较或淡红色，无胞核，中心部位有较多紫红色嗜苯胺蓝颗粒。多紫红色嗜苯胺蓝颗粒。n 电子显微镜：血小板结构由外向电子显微镜：血小板结构由外向内可分为表面结构、溶胶质层结构内可分为表面结构、溶胶质层结构和细胞器内含物三层。和细胞器内含物三层。1 1血小板表面结构血小板表面结构 由血小板膜、细胞外衣和开放管道系统（由血小板膜、细胞外衣和开放管道系统（open open

24、 canalicularcanalicular system system，OCSOCS）组成。）组成。重要成分：磷脂酰丝氨酸重要成分：磷脂酰丝氨酸 （phosphatidylserinephosphatidylserine，PSPS）/血细胞第血细胞第3 3因子（因子（PF3PF3）血小板膜糖蛋白等。血小板膜糖蛋白等。2 2溶胶质层结构溶胶质层结构 由微管、微丝、致密管道系统等组成。由微管、微丝、致密管道系统等组成。3 3细胞器内含物结构细胞器内含物结构 主要致密颗粒和主要致密颗粒和-颗粒、溶酶体组成。颗粒、溶酶体组成。血小板超微结构血小板超微结构功能基础功能基础第十三章第十三章 第二节第二

25、节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验花生四烯酸是膜磷脂代花生四烯酸是膜磷脂代谢产物，其代谢途径是谢产物，其代谢途径是血小板发挥聚集止血功血小板发挥聚集止血功能的主要代谢基础。能的主要代谢基础。血小板的花生四烯酸血小板的花生四烯酸代谢途径代谢途径血管内皮细胞内完成血管内皮细胞内完成23min后后前列环素前列环素合成酶合成酶血栓烷血栓烷A2合成酶合成酶环氧化酶环氧化酶花生四烯酸花生四烯酸膜磷脂膜磷脂磷脂酶磷脂酶A2前列腺素环内过氧化物前列腺素环内过氧化物PGG2过氧化物酶过氧化物酶前列腺素环内过氧化物前列腺素环内过氧化物PGH2前列环素（前列环素（PGI2）血栓烷血栓烷A2（TXA2）30

26、s后后6-酮酮-PGF1（稳定产物）（稳定产物）血栓烷血栓烷B2（TXB2）（稳定产物）（稳定产物）血小板内完成血小板内完成第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验血小板血小板粘附粘附促凝促凝作用作用血小板血小板聚集聚集释放释放反应反应血块血块收缩收缩血小板的止血功能血小板的止血功能第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验血小板的止血功能血小板的止血功能血小板的止血功能血小板的止血功能ADP血小板进一步激活、释放血块收缩内皮损伤（内皮下组织暴露）血小板粘附血小板初期释放ADP等血小板聚集纤维蛋白形成坚固的凝血块血小板促凝作用5-H

27、T第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验类 别成分活性胺5-HT，组胺，肾上腺素，去甲肾上腺素腺嘌呤核苷酸ADP,ATP,cAMP阳离子Ca2+,K+血小板因子PF3,PF4等凝血因子凝血因子I，V，VIII，XIII血小板蛋白-TG，血小板糖蛋白等血栓烷TXA2血小板的主要释放产物血小板的主要释放产物血小板功能的实验室检查血小板功能的实验室检查第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验血小板粘附实验血小板粘附实验 PAdTPAdT，玻珠柱法，玻珠柱法 原理原理 血小板粘附试验（血小板粘附试验（platelet platelet

28、adhensionadhension test test，PAdTPAdT）利用血小板在体外可黏附于玻璃表面的原理设）利用血小板在体外可黏附于玻璃表面的原理设计，测定方法有多种，包括玻珠柱法、玻球法等。当计，测定方法有多种，包括玻珠柱法、玻球法等。当血液与一定表面积的玻璃接触一定时间后，血小板粘血液与一定表面积的玻璃接触一定时间后，血小板粘附于玻璃表面，因此血液中血小板数会降低。通过计附于玻璃表面，因此血液中血小板数会降低。通过计数接触前、后的血中血小板数，即可计算出血小板粘数接触前、后的血中血小板数，即可计算出血小板粘附率。该试验为判断血小板粘附能力的常用指标。附率。该试验为判断血小板粘附能

29、力的常用指标。第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验 PAdTPAdT 操作操作n将玻珠柱管（内径将玻珠柱管（内径3mm，长，长9.4cm，内装直径，内装直径0.30.5mm玻珠玻珠1.5g，管两端封以，管两端封以0.05cm孔径的尼龙布）孔径的尼龙布）与注射器相连；与注射器相连；n行肘正中静脉穿刺；行肘正中静脉穿刺；n当血液接触玻珠时开始计时，掌握好血液通过玻珠柱当血液接触玻珠时开始计时，掌握好血液通过玻珠柱的速度。在的速度。在4等分的玻珠柱中，血液通过每段速度为等分的玻珠柱中，血液通过每段速度为5s，共，共20s。经过玻珠柱后，再按原速抽血。经过玻珠柱后，

30、再按原速抽血5s；n采集通过玻珠柱前后的血液，作血小板计数。采集通过玻珠柱前后的血液，作血小板计数。第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验血小板粘附率（血小板粘附率（%）=100%100%参考值：参考值：62.5%62.5%8.6%8.6%注意事项注意事项取血过程必须顺利，掌握血液通过玻珠柱的速度。取血过程必须顺利，掌握血液通过玻珠柱的速度。待用玻珠柱应置于干燥器中储存，受潮后粘附率下降。待用玻珠柱应置于干燥器中储存，受潮后粘附率下降。血小板计数要准确，宜作血小板计数要准确，宜作23次后取平均值次后取平均值。第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验

31、血小板止血作用及检验 PAdTPAdT 参考区间参考区间粘附前血小板数粘附前血小板数 -粘附后血小板数粘附后血小板数粘附前血小板数粘附前血小板数 PAdTPAdT 应用评价应用评价血小板粘附率减低：见于先天性和继发性血小板功能异常（以后者多血小板粘附率减低：见于先天性和继发性血小板功能异常（以后者多见），如血管性血友病、巨大血小板综合征、爱见），如血管性血友病、巨大血小板综合征、爱-唐综合征、低唐综合征、低（无）纤维蛋白血症、异常纤维蛋白血症、急性白血病、骨髓（无）纤维蛋白血症、异常纤维蛋白血症、急性白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾病、肝硬化、尿毒症、服用抗增生异常综合征、骨髓增殖性疾

32、病、肝硬化、尿毒症、服用抗血小板药物等。血小板药物等。血小板粘附率增高：见于血栓前状态和血栓形成性疾病，如高血压病、血小板粘附率增高：见于血栓前状态和血栓形成性疾病，如高血压病、糖尿病、妊娠高血压综合征、肾小球肾炎、肾病综合征、心脏糖尿病、妊娠高血压综合征、肾小球肾炎、肾病综合征、心脏瓣膜置换术后、心绞痛、心肌梗死、脑梗死、深静脉血栓形成、瓣膜置换术后、心绞痛、心肌梗死、脑梗死、深静脉血栓形成、口服避孕药等。口服避孕药等。应用评价应用评价 是检测血小板功能的基本试验之一，用于遗传性与获得性是检测血小板功能的基本试验之一，用于遗传性与获得性血小板功能缺陷疾病的诊断、血栓前状态和血栓性疾病检查以血

33、小板功能缺陷疾病的诊断、血栓前状态和血栓性疾病检查以及抗血小板药物治疗监测。但特异性差，操作较复杂，易受较及抗血小板药物治疗监测。但特异性差，操作较复杂，易受较多人为因素的影响，致使其在临床的实际应用受限。多人为因素的影响，致使其在临床的实际应用受限。第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验 血小板聚集实验血小板聚集实验 PAgTPAgT 原理原理 当一定数量的诱导剂存在时血小板即发生聚集。当一定数量的诱导剂存在时血小板即发生聚集。以贫血小板血浆（以贫血小板血浆（PPPPPP）设定最低浊度（）设定最低浊度（100%100%透光度），透光度），富血小板血浆（富血小

34、板血浆（PRPPRP）设定最高浊度（）设定最高浊度（0%0%透光度）。在透光度）。在PRPPRP血浆中加入诱聚剂诱导血小板聚集，测定血浆浊度血浆中加入诱聚剂诱导血小板聚集，测定血浆浊度的变化，绘制血小板聚集曲线。通过分析血小板聚集的变化，绘制血小板聚集曲线。通过分析血小板聚集曲线的最大聚集率（曲线的最大聚集率（MARMAR）、达到最大幅度的时间、达）、达到最大幅度的时间、达到到1/21/2最大幅度的时间、最大幅度的时间、2min2min的幅度、延迟时间、斜率的幅度、延迟时间、斜率参数判断血小板的聚集的程度和速度。参数判断血小板的聚集的程度和速度。第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及

35、检验血小板止血作用及检验 PAgTPAgT 操作操作1.用硅化注射器从肘静脉取血用硅化注射器从肘静脉取血4.5ml，注入含，注入含0.5ml 109mmol/L枸橼枸橼酸钠的硅化或塑料离心管中，充分混匀；酸钠的硅化或塑料离心管中，充分混匀；2.以以1000r/min室温下离心室温下离心10min，分离，分离PRP，小心取出上层血浆，小心取出上层血浆，计数血小板并调至（计数血小板并调至（100200）109/L；将上述剩余血液以将上述剩余血液以3000r/min离心离心20min，分离，分离PPP（上层较透明（上层较透明的液体），血小板计数一般要求低于的液体），血小板计数一般要求低于20109/

36、L；3.按照不同的聚集仪的要求，吸取所需的按照不同的聚集仪的要求，吸取所需的PRP和和PPP置于比色杯中，置于比色杯中，分别调整好透光度为分别调整好透光度为10和和0；4.打开记录仪走纸开关，描记打开记录仪走纸开关，描记10s的的PRP基线，随后将适量诱聚剂基线，随后将适量诱聚剂（视仪器要求而定，一般为反应体系总量的（视仪器要求而定，一般为反应体系总量的1/10左右）加入左右）加入PRP中，中，并开始搅拌，记录浊度改变曲线，测定时间一般为并开始搅拌，记录浊度改变曲线，测定时间一般为610min。第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验不同仪器及诱聚剂或者不同浓度

37、、剂量的同种诱聚剂有不同的参考范围。不同仪器及诱聚剂或者不同浓度、剂量的同种诱聚剂有不同的参考范围。MG-196MG-196型血小板聚集仪为例，几种常用的诱聚剂测得的参考值型血小板聚集仪为例，几种常用的诱聚剂测得的参考值:第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验 PAgTPAgT 参考区间参考区间ADP(1.0mol/ml)ADP(0.5mol/ml)肾上腺素肾上腺素(4.0g/ml)胶原胶原(3.0g/ml)瑞斯托霉素瑞斯托霉素(1.5mg/ml)最大幅度（最大幅度（%）48.6 78.825 5050.2 85.654 9076.1 98.9达到最大幅度时间

38、（达到最大幅度时间（S）150 29068 230220 360220 290200 2802min时幅度（时幅度（%）38 6820 4225 5022 6155 90单峰或双峰曲线单峰或双峰曲线双峰双峰双峰双峰双峰双峰单峰单峰双峰双峰第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验 血小板聚集曲线血小板聚集曲线 PAgTPAgT 应用评价应用评价应用评价应用评价 n本试验是检测血小板功能的基本试验之一，试验简便、快本试验是检测血小板功能的基本试验之一，试验简便、快速，成本低廉，在临床上开展比较广泛。速，成本低廉，在临床上开展比较广泛。n血小板聚集率减低：见于血小板无

39、力症、血小板贮存池病、血小板聚集率减低：见于血小板无力症、血小板贮存池病、血管性血友病、巨大血小板综合征、低（无）纤维蛋白原血管性血友病、巨大血小板综合征、低（无）纤维蛋白原血症、肝硬化、尿毒症、维生素血症、肝硬化、尿毒症、维生素B12B12缺乏症、细菌性心内缺乏症、细菌性心内膜炎、急性白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾膜炎、急性白血病、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾病、特发性血小板减少性紫癜、服用抗血小板药物等。病、特发性血小板减少性紫癜、服用抗血小板药物等。n血小板聚集率增高血液高凝状态和（或）血栓形成性疾病，血小板聚集率增高血液高凝状态和（或）血栓形成性疾病，如动脉粥样硬化性心脏

40、病、糖尿病、肾小球肾炎、肾病综如动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病、肾小球肾炎、肾病综合征、心脏瓣膜置换术后、深静脉血栓形成、高脂饮食、合征、心脏瓣膜置换术后、深静脉血栓形成、高脂饮食、口服避孕药和吸烟等。口服避孕药和吸烟等。第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验PAgTPAgT 注意事项注意事项 标本采集后置于室温（标本采集后置于室温（2525C C左右）下保存左右）下保存,并在并在3 3小时内完成试小时内完成试验验;试验前至少试验前至少1 1周应停用一切抑制血小板聚集的药物，如阿司匹周应停用一切抑制血小板聚集的药物，如阿司匹林、潘生丁、肝素、双香豆素等。林、潘生

41、丁、肝素、双香豆素等。采血前一天应避免使用牛奶、豆浆等高脂肪食物以免影响悬采血前一天应避免使用牛奶、豆浆等高脂肪食物以免影响悬液透光度。液透光度。抗凝剂应选用枸橼酸钠，而忌用抗凝剂应选用枸橼酸钠，而忌用EDTAEDTA。注意诱聚剂的保存，如注意诱聚剂的保存，如ADPADP在保存过程中会自行分解产生在保存过程中会自行分解产生AMPAMP，故配制后溶液应保存与故配制后溶液应保存与-20-20C C冰箱，但保存一般不应超过冰箱，但保存一般不应超过6 6个月；肾个月；肾上腺素应避光防止减少分解。此外，诱聚剂的种类和浓度对血小板上腺素应避光防止减少分解。此外，诱聚剂的种类和浓度对血小板聚集结果都有影响，

42、临床判断是应注明所用诱聚剂的种类和浓度。聚集结果都有影响，临床判断是应注明所用诱聚剂的种类和浓度。各实验室也应建立自己的参考值。各实验室也应建立自己的参考值。第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验血小板第血小板第3 3因子有效性测定（因子有效性测定（PF3aTPF3aT 原理原理 PF3 PF3是血小板活化过程中形成的一种膜表面磷是血小板活化过程中形成的一种膜表面磷脂成分（即磷脂酰丝氨酸），是血小板参与凝血过程脂成分（即磷脂酰丝氨酸），是血小板参与凝血过程的重要因子。试验将正常人与受检者的的重要因子。试验将正常人与受检者的PRP(PRP(富含血小富含血小板血浆

43、板血浆)和和PPPPPP（贫血小板血浆）交叉组合（贫血小板血浆）交叉组合,利用白陶土利用白陶土作为血小板活化剂，氯化钙作为凝血反应启动剂，促作为血小板活化剂，氯化钙作为凝血反应启动剂，促进进PF3PF3形成。通过测定各组标本的凝固时间，比较各组形成。通过测定各组标本的凝固时间，比较各组时差，了解受检者时差，了解受检者PF3PF3是否有缺陷。是否有缺陷。第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验PF3aT PF3aT 操作步骤操作步骤1.1.采血，待测血样和正常对照血样各一份，加入抗凝剂混匀；采血，待测血样和正常对照血样各一份，加入抗凝剂混匀；2.2.分别制备分别制

44、备PPPPPP和和PRPPRP；3.3.准备四只试管，按下表加样；准备四只试管，按下表加样；4.4.将上述将上述4 4只试管置于只试管置于3737C C水浴预温水浴预温2min2min后，依次加入白陶土悬液后，依次加入白陶土悬液0.2ml0.2ml，并记录时间；，并记录时间；5.5.加入白陶土加入白陶土20min20min后，向小试管中依次加入后，向小试管中依次加入0.025mol/L0.025mol/L氯化钙氯化钙0.2ml0.2ml，开动秒表测定凝固时间。，开动秒表测定凝固时间。组别患者血浆（ml）正常血浆（ml）PRPPPPPRPPPP10.10.120.10.130.10.140.10

45、.1第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验 PF3aTPF3aT 参考区间参考区间 第第1 1组较第组较第2 2组延长如超过组延长如超过5s5s以上，即为以上，即为PF3PF3有效有效性减低。第性减低。第3 3组、第组、第4 4组分别为患者和正常人（作为对组分别为患者和正常人（作为对照管），患者照管），患者PF3PF3有缺陷或内源凝血因子有缺陷时有缺陷或内源凝血因子有缺陷时（如血友病），第（如血友病），第3 3组凝固时间比第组凝固时间比第4 4组长。组长。第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验 PF3aTPF3aT 应用评价应

46、用评价 应用评价应用评价 PF3aT PF3aT是最常用的血小板凝血活性检测试是最常用的血小板凝血活性检测试验，方法简单，易于操作。验，方法简单，易于操作。nPF3PF3有效性减低：见于先天性血小板有效性减低：见于先天性血小板PF3PF3缺乏症、血小缺乏症、血小板无力症、巨大血小板综合征、肝硬化、尿毒症、弥板无力症、巨大血小板综合征、肝硬化、尿毒症、弥散性血管内凝血、系统性红斑狼疮、特发性血小板减散性血管内凝血、系统性红斑狼疮、特发性血小板减少性紫癜、骨髓增生异常综合征、急性白血病及服用少性紫癜、骨髓增生异常综合征、急性白血病及服用抗血小板药物等。抗血小板药物等。nPF3PF3有效性增加：常见

47、于高脂血症、动脉粥样硬化、心有效性增加：常见于高脂血症、动脉粥样硬化、心肌梗死、糖尿病伴血管病变等。肌梗死、糖尿病伴血管病变等。第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验血小板膜糖蛋白测定血小板膜糖蛋白测定第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验n 血小板膜糖蛋白（血小板膜糖蛋白（GlucoproteinGlucoprotein，GPGP）是血小板功能和）是血小板功能和血小板与其他活性物质作用的基础，一些糖蛋白如血小板与其他活性物质作用的基础，一些糖蛋白如GP GP IaIa、GP GP IbIb、GP GP IIbIIb、GP G

48、P IIIaIIIa等已被确定为血小板特异抗原。等已被确定为血小板特异抗原。n GP GP 分子数量或结构异常均可导致出血或血栓形成。分子数量或结构异常均可导致出血或血栓形成。n 活化血小板与静止血小板相比，活化血小板与静止血小板相比，GP GP 的种类、结构、含量的种类、结构、含量等亦呈现显著变化。等亦呈现显著变化。n 可使用可使用ELISAELISA或流式细胞术（或流式细胞术（FCMFCM）分析血小板膜糖蛋白）分析血小板膜糖蛋白的表达。的表达。主要血小板膜糖蛋白及功能主要血小板膜糖蛋白及功能第十三章第十三章 第二节第二节 血小板止血作用及检验血小板止血作用及检验名名 称称CD名称名称分子量

49、分子量 功能特性功能特性GP IaCD49b150 000与与GP IIa形成复合物，是胶原的受体形成复合物，是胶原的受体GP IbCD42c170 000与与GP IX、GP V形成复合物，是形成复合物，是vWF的受体，参与血的受体，参与血小板粘附反应，缺乏或减少时血小板粘附功能减低，小板粘附反应，缺乏或减少时血小板粘附功能减低，见于巨大血小板综合征见于巨大血小板综合征GP IcCD49f140 000与与GP II形成复合物，是层素（形成复合物，是层素（laminin）的受体）的受体GP IIaCD29138 000与与GP Ia和和Ic形成复合物，是胶原和层素的受体形成复合物，是胶原和层

50、素的受体GP IIb和和IIIaCD41aIIb 145 000IIIa 90 000GP IIb与与IIIa形成复合物，是纤维蛋白原（形成复合物，是纤维蛋白原（Fg）的受）的受体，参与血小板聚集反应，缺乏或减少时血小板聚集体，参与血小板聚集反应，缺乏或减少时血小板聚集功能减低，见于血小板无力症功能减低，见于血小板无力症GP IVCD3688 000是是TSP的受体的受体GP V82 000和和GP Ib、GP IX构成构成vWF受体受体GP Ib-V-IXGP IXCD42a17 000和和GP Ib、GP V形成复合物，构成形成复合物，构成vWF受体受体P-selectin140 000即