医学精品课件：脓汁和粪便标本中病原菌的检测-4.ppt

1、斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支， 镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张。,器材准备,染色瓶6组，染色架8个。,医学微生物学实验 综合性实验一,脓汁和粪便标本中病原菌的检测（四） 斜面培养物的观察 革兰染色法 肉汤接种法 显微镜油镜的使用,斜面培养物的观察,从普通平板上挑取的金黄色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，金黄色或白色。 从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已经没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明或半透明。 为了讲解方便，以后的实验，仍然沿用初次分离得到菌落的颜色紫黑或粉红。 从斜面上取菌时，一般只取半个小菌落大

2、小的菌量；接种环或接种针在菌苔上轻刮一下即可。,Isolation and identification of bacteria from clinical specimens (Pus & Stool) - workflow, culture media preparation, isolated culture of bacteria, pure culture of bacteria, morphological examination of bacteria, biochemisty, mobility, SCT & AST of bacteria, serologic test, r

3、esults analysis paper writing,细菌染色法,单染色法：只用一种染料染色，能清楚观察菌体大小、形态与排列，不能鉴别细菌。 复染色法（鉴别染色）：采用两种以上的不同染料进行先后染色，可将细菌染成不同的颜色，以便鉴别细菌。 抗酸染色:用于检查结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌等抗酸性细菌(一些一旦用某些方法染色后，能够抵抗酸性酒精脱色的细菌)，阳性者为红色。 特殊染色：荚膜染色，芽胞染色，鞭毛染色，极体染色（用于白喉杆菌异染颗粒染色）。,结核分枝杆菌 抗酸染色,麻风分枝杆菌 抗酸染色,产气荚膜梭菌荚膜 Hiss 染色,破伤风梭菌芽胞 芽胞染色,变形杆菌鞭毛 Leifson染色,白

4、喉棒状杆菌异染颗粒 Albert染色,革兰染色法 Gram Staining 革兰染色法是丹麦内科医生 Christain Gram于1884年创立的一种细菌染色方法，已有130多年的历史，仍在广泛使用。,革兰染色法原理的三种学说,通透性学说：G+菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，酒精不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。G-菌细胞壁比较疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫碘复合物容易被酒精脱出。 等电学说：G+菌等电点(pH23)比G-菌(pH45)低，一般染色时染液的酸碱度在pH7

5、.0左右，电离后阳性菌带的负电荷比阴性菌多，因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。 化学学说：G+菌细胞内含有某种特殊化学成分，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它与染料媒染剂复合物结合，使已着色的细菌不易脱色。,革兰染色的意义,鉴别细菌：把细菌分成G+和G-两大类。 选择抗菌药物：例如G+球菌对青霉素敏感,G-杆菌耐药。 了解细菌的致病机理：G+菌大多产生外毒素,G-菌产生内毒素。 革兰染色的步骤 涂片 干燥 固定 染色,涂片的制备 Prepare a Smear,甲金黄，紫黑。乙白色，粉红。 丙金黄，紫黑。丁、戊白色，粉红。, 细菌合适, 细菌较多,接种环取盐水3ul2滴,水滴

6、间距小于2cm。,取菌苔少许（1mm小菌落半个）与盐水混匀，涂成大于1cm2均匀涂膜。,涂毕环移至涂膜中 央侧立，待环内菌膜破裂，接种环烧灼灭菌。,固定 Fixation,涂片smear,干燥dry,手持载玻片一端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间23秒钟。,促使菌体蛋白质凝固，固定在载玻片上，以免染色水洗的时候，细菌被水洗掉。,革兰染色方法步骤 The Gram Stain Procedure,涂片 干燥 固定 结晶紫 初染1分钟水洗 卢戈碘液媒染1分钟水洗 95乙醇脱色约20秒钟水洗 稀释品红复染1分钟水洗 吸干,镜检。 取菌适量,涂片均匀,水洗轻缓,脱色适当。 影响革兰染色的

7、关键步骤是涂片和脱色。,革兰阳性菌 Gram-Positive,革兰阴性菌 Gram-Negative,G+链球菌,G-双球菌,G+杆菌,G+短杆菌,G-弧菌,G-螺菌,液体培养基接种 Broth Transfer 悬浮法 Suspending Method,甲金黄, 乙白色, 丙紫黑, 丁、戊粉红。 标记：组号，颜色,37培养4小时,45108cfu/ml,接种环斜面取菌，在靠近培养基液面管壁上，上下研磨接种。,在管壁上，将接种环内的菌膜拍破。退出接种环，烧灼灭菌。,生物安全警告 BIOHAZARD,本次实验操作，可产生几十至几百个微生物气溶胶颗粒。 气溶胶粒径100um沉降很快,50um在

8、0.4s内扩散开,5um通过呼吸道直接到达肺泡。 Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。 实验时应坐稳，很专注，不分心，在火焰周围1020厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话，以免感染病原菌。,显微镜油镜的使用,将标本放置、移动到光路上，用“黄色圈”的10物镜找到、看清楚标本。 将聚光器调到最高处。 调整孔径光阑,将与物镜相对应倍率调到正面（10100）。 在标本观察部位上滴加一滴香柏油。 将“白色圈”100物镜放入光路，浸泡于香柏油中，可看到模糊物象。 调整亮度及微调旋钮，直到物象清晰为止观察物象，记录结果关闭电源。 油镜处理

9、：擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭擦镜纸擦拭油镜。 显微镜罩上防尘罩 横放在实验柜内。 (顺德校区）实验台两侧的电源插座，只能插入一个插头，请选择离你最近的电源插座。 （校本部）实验台中间，三个位的插座，中间那位插孔没有电，不能使用，只能用两侧的插座。,100倍浸油物镜使用方法,温馨提示,因染色场地受限，甲、丙先涂片染色，后接种肉汤。乙、丁先接种肉汤，后涂片染色。 待染色和肉汤接种完毕，桌面收拾干净，才可镜检，以免污染。 镜检过的载玻片不必擦拭，直接投入玻片缸内消毒、灭菌。,革兰染色法P15 甲金黄，紫黑 乙金黄，紫黑 丙白色，粉红 丁白色，粉红 肉汤接种法P10

10、甲金黄 乙白色 丙紫黑 丁粉红 油镜的使用P13 10物镜看清标本滴加香柏油100油镜浸泡油中模糊物象细调节调焦，观察物像记录结果关闭电源 擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭擦镜纸擦拭油镜。 聚光镜孔径光阑环上的物镜倍率（10或100）转到正面。,思考题,革兰染色法的关键步骤是什么?为什么? 染色时为什么通常要用新鲜的细菌培养物? 如何使用油镜?,实验小结 用普通平板，从浓汁标本中分离得到金黄、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。,葡萄球菌(电镜)

11、,金黄、白色形态与染色(油镜),酸葡萄,金黄、白色菌落特征,黄色,白色,用伊红美蓝平板,从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，均为G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。,杆菌(电镜),紫黑、粉红细菌的形态与染色(油镜),紫黑,紫黑、粉红菌落特征,粉红,常用器材摆放顺序：电源插座试管架酒精灯污物盘。 试管架上器材：靠近插座一侧第1列放置接种针,第2列放置 接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。,器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。,实验器材 整齐有序,革兰染色瓶,染色架,石蜡油,拭镜纸,吸水纸,乙醇乙醚,微生物学器材柜-1（边台西侧中段）,染色、镜检器材收拾入柜依次摆整齐,器材柜（下层）,酒精棉球 镊子,革兰染色瓶,载玻片,镜油瓶, 革兰染色器材 收拾入柜 依次摆整齐 ,