医学精品课件：药分第十章.ppt

1、第十章 外源基因表达与基因工程药物,目 录,概述 基因表达的原理 基因表达的类型 外源基因表达的基本过程 目的基因的获得 目的基因与表达载体的重组 重组表达载体导入宿主细胞及其筛选与确认 目的基因的表达,原核细胞表达系统 表达载体 表达宿主细胞 真核细胞表达系统 酵母细胞表达系统 昆虫细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统 重组基因工程药物 重组人胰岛素及其突变体 重组人凝血因子VIII 重组人尿激酶与尿激酶原 重组人生长激素,第一节 概 述,外源基因的表达 利用细胞内相关酶系及其调控系统，将外源基因转录成肽链或加工成活性蛋白质的过程。 具体的说，利用分子生物学技术，在体外将编码外源蛋白质的基因重

2、组至适宜的表达载体上，通过相关技术将其导入宿主细胞内，借助宿主细胞的转录、翻译或翻译后修饰酶系及相应的调控系统，在宿主细胞合成或分泌具有原有生物活性的蛋白质。 目的 针对难以或无法从自然界直接提取、分离、纯化所获得的，或制造成本、产量规模等受限制的，或利用化学方法无法合成的多肽，蛋白质、酶这类生物分子药物，利用细胞或组织或器官或生命体的复制、转录、翻译及其调控系统以及翻译后加工、修饰等体系，按人的意愿生物合成这些生物分子，并从中将表达产物分离纯化至预期程度，最终加工成药品。,基因工程概念,基因工程（Genetic Engineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的

3、DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程，从而改变生物特性或创造新的生物类型的技术,基因工程的发展史,一、基因表达基本原理,基因表达(gene expression) 是指储存遗传信息的基因在各种调节机制下经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录和翻译，产生有生物活性的蛋白质过程。 基因重组 主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达。 基因工程 核心是基因表达技术。,二、基因表达基本类型,第二节 外源基因表达基本过程,外源基因表达 实现外源基因的表达，就是利用基因工程技术，将编码外源蛋白的基因与特定的表达载体重组， 运用相应技术将重组表达载体导入特定的宿主

4、细胞， 重组表达载体以游离形式存在于宿主细胞内；或者含有外源基因转录单位的单元，通过细胞内DNA重组过程整合到宿主细胞染色体DNA中， 利用特定诱导表达单元及其调控系统，实现外源蛋白的诱导表达；或者依据宿主细胞的自然状况实现表达。 四个要素 工具酶 载体 目的基因 受体（宿主）细胞,基因工程的基本过程,目的基因的获取：从生物体中分离或人工合成 重组载体的构建：对目的基因和载体DNA进行剪切、修饰，在连接酶的作用下连接形成完整有复制能力的重组体 重组DNA分子导入合适的受体细胞：重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增 重组体的筛选与确认：直接筛选法（如抗药标志选择）和免疫学方法等 目的基因的表达：

5、原核与真核表达,一、目的基因的获得,外源基因表达的第一步是获得目的基因 获得目的基因的主要方法包括： 化学合成 RT-PCR从含有目的基因的总RNA或mRNA中扩增 从cDNA文库或基因组文库中PCR扩增 通过杂交技术筛选 利用合适的筛淘技术从各种文库中筛选,聚合酶链式反应(PCR),PCR（polymerase chain reaction）: 在体外由引物介导的、酶促快速合成扩增特定基因或DNA片段的一种方法。,原理 在适当缓冲液（Mg2+）反应体系中，根据碱基配对原理利用DNA聚合酶催化和dNTPs的参与下，引物依赖于DNA模板特性指导DNA合成,基本步骤,变性：双链DNA解离成为单链(

6、90以上) 退火(复性)：引物与模板DNA单链的互补序列配对结合（50 左右） 延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对原则，合成一条新的互补链 （70 左右）,PCR反应五要素,引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ PCR反应的特异性决定因素： 引物与模板DNA特异正确的结合 碱基配对原则 Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性 靶基因的特异性与保守性,PCR的应用,研究基因克隆；DNA测序；分析突变 诊断细菌、病毒、寄生虫检测及诊断 人类基因组工程遗传图谱的构建；DNA测序；表达图谱 法医犯罪现场标本分析 肿瘤各种肿瘤检测 其他,

7、二、目的基因与表达载体的重组,重组载体的构建：对目的基因和载体DNA进行剪切、修饰，在连接酶的作用下连接形成完整有复制能力的重组体。,（一）载体,对于外源基因的表达，第二个问题就是选择合适的表达载体并将目的基因重组至表达载体上。 表达载体主要包括：质粒载体、噬菌体或病毒载体。 表达载体是目的基因在宿主细胞中遗传、转录、翻译以及可能的翻译后修饰加工的保障。,基因工程载体的基本条件,能在宿主细胞中复制繁殖 容易进入宿主细胞 有合适的限制性核酸内切酶位点，容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制 有容易被识别筛选的标志 容易从宿主细胞中分离纯化出来,基因工程载体分类,根据载体

8、的分子生物学特性划分 质粒型载体环状dsDNA分子，自主复制 病毒型载体环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒 混合型载体具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性,根据载体功能划分： 克隆载体质粒、噬菌体、粘性质粒、M13噬菌体 表达载体大肠杆菌表达载体、哺乳动物细胞表达载体,常用载体,质粒(plasmid) 独立于细菌染色体以外的遗传物质，能够自我复制的双链闭合环状DNA分子。 大多数质粒DNA是是环状双链的DNA分子 复制类型分为严紧型和松弛型 有共价闭合环形、开环和线性三种构型 泳动速度：SCDNA LDNA OCDNA 质粒具有不相容性 具有转移现象和迁移作用,

9、 噬菌体载体,特点 双链DNA分子（线性或环形） 两端具有12个nt单链互补粘性末端 具非必需区（中间区约1/3长度） 可在E.Coli中大量繁殖 可克隆15Kb左右的外源基因,M13噬菌体(M13 phage),只感染有F性菌毛的大肠杆菌噬菌体 基因组DNA全长6.5kb（单链） 感染后，可复制成双链DNA（RF，DNA） RF只有（+）链复制，相当于质粒载体 优点： 既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。 缺点：插入大的DNA片段后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之内，克隆300-400bp的片段十分稳定。,大容量载体,细菌人工染色体(BACs

10、): E.coli F质粒，供体DNA300kb,用于大基因组分析 P1人工染色体(PACs)：噬菌体P1，需要体外包装盒转导，供体DNA约100kb,用于大基因组分析 酵母人工染色体(YACs)：酿酒酵母着丝粒、端粒和自主复制序列，供体DNA2000kb,用于大基因组分析和YAC转基因动物,穿梭载体(shuttle vector),能在两种不同的生物中复制的载体,具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因 有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状 具有多克隆位点 在细菌中用于扩增克隆的基因 在真核生物中用于基因表达分析,表达载体（Expression vectors）,真核细胞载体,哺乳

11、动物细胞的病毒载体 含有原核基因序列即：复制子和抗性基因 含有哺乳动物细胞启动子和增强元件使外源基因有效转录 转录终止信号和poly(A)信号 含有可选择的剪切信号 含有一个以上的限制性酶切位点,酵母载体 组成遗传标记；调控序列（ARS、环状质粒DNA、启动子）；由质粒DNA与酵母DNA重组的穿梭质粒 杆状病毒载体昆虫细胞多角病毒载体 具有蛋白修饰、加工和转运体系 产物可溶性表达 适于克隆大片外源DNA 不侵染脊椎动物,真核细胞载体,（二）重组,体外重组技术的建立是建立在一系列可以在体外应用的DNA限制性内切酶和DNA连接酶，以及PCR技术的推广。 目的基因和载体DNA分子的体外重组关键在于：

12、选择合适的重组位点、剪切位点；以及剪切后适当的条件将目的基因和载体DNA分子连接获得重组分子。,基因工程相关酶学,限制性核酸内切酶,具有识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶,型：修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性 型：内切酶活性和修饰酶活性，专一性强。既具有切割位点的专一性, 也具有识别位点的专一性, 一般在识别序列内切割 型：作用方式同型,命名方式,型限制性核酸内切酶,基本特性 识别ds-DNA中含-8个相连的碱基对组成的特定回文序列 断裂后形成的DNA片段具有互补碱基的单链延伸末端（粘性末端）或平末端,同裂酶(isoschizomer)来源

13、不同, 识别和切割位点相同 同尾酶(isoaudamers)来源、识别序列和切割方式均不相同，但产生的限制性片段却是相同的粘性末端,型限制性核酸内切酶,限制性内切酶对DNA的消化作用及其片段化 消化作用以同型二聚体形式与靶DNA序列作用，所识别的靶序列大小决定着DNA片段的大小 片段化:单酶切、双酶切、一部分酶切 具有粘性末端DNA片段的连接 不同的DNA片段通过互补的粘性末端配对连接分子间连接 同一片段的两个互补末端之间碱基配对形成环形分子内连接,型限制性核酸内切酶,载体与目的片段连接,影响限制性内切酶活性的因素 DNA的纯度 DNA甲基化程度 底物DNA的分子构型 反应温度 反应系统组成

14、酶量、反应体积、酶切时间,限制酶的用途 DNA重组与构建新基因组文库 组建DNA物理图谱 DNA 分子杂交 制备DNA放射性探针 DNA序列分析,型限制性核酸内切酶,DNA连接酶,封闭DNA链上缺口酶，借助能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。用于DNA重组和质粒的构建,大肠杆菌DNA连接酶：只能连接具粘性末端DNA分子，以NAD作辅助因子 T4 DNA连接酶：连接粘性末端，高浓度可连接平末端，要求3-OH和5-PO4 。催化过程需要ATP和Mg,聚合酶,以DNA(RNA)为模板，催化DNA(RNA)的体外合成,特点： 以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成

15、DNA 需要模板和引物的存在 不能起始合成新的DNA链 催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端 催化DNA合成的方向是53,聚合酶的分类及特点,大肠杆菌DNA聚合酶： 53的聚合作用 3 5 的外切酶活性 53外切酶活性 Klenow 聚合酶： 53聚合酶活性 3 5 外切酶活性 没有53外切酶活性 用于填补DNA单链末端成为双链,聚合酶的分类及特点,T4-DNA聚合酶 ：无53外切酶活性 、需要一条有引物的单链DNA作模板 、 3 5 外切酶活性 Taq DNA 聚合酶： 53聚合酶活性 53外切酶活性，有链置换合成能力 不具有3 5 外切酶活性，没有校正功能 良好的热稳定性 用于D

16、NA序列分析和PCR反应,逆转录酶（reversetranscriptase）,两类：禽类成骨细胞性白血病病毒逆转录酶(AMV) moloney小鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV) 作用： 以RNA为模板合成DNA,构建cDNA文库 RT-PCR 制备杂交探针,以RNA为模板合成DNA的酶( RNA指导的DNA聚合酶),碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）： 去除DNA /RNA 5-P，制备载体时可防止载体自身连接， 提高重组效率 末端脱氧核苷酰转移酶： 在DNA的3-OH上，加上 dNTP,DNA和RNA的修饰酶,宿主细胞,宿主细胞（Host Cell） 指接纳重组子并实现

17、重组子的外源基因转录、扩增或表达的受体细胞。 分类 真核细胞：酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞。 原核细胞：大肠埃希氏菌、枯草杆菌等。,宿主细胞,基因工程使用的宿主细胞 除了基本的人为改造外，还会针对具体目的加以改造。 特点 限制性内切酶缺陷型 抑郁重组子导入 遗传稳定性好 安全性高 功能互补 较好的翻译后加工机制 蛋白水解酶基因缺陷或表达水平低,重组分子导入受体细胞,转导(transduction) 指噬菌体颗粒感染宿主细胞，通过特定的途径，将噬菌体核酸注入宿主细胞内的过程，并使噬菌体核酸在宿主细胞内实现复制、转录、翻译或子代噬菌体的繁殖。 转化(transformation) 指感受态细胞

18、接纳外源DNA分子的过程，并使其在宿主细胞内实现复制、扩增、转录与翻译。 感受态(competence):细胞在一定生理状态时可摄取外源性遗传物质，并使受体细胞产生新的遗传性状。 电转化 利用电穿孔法，将外源DNA或载体DNA导入宿主细胞，并使载体DNA在宿主细胞内实现复制、扩增、转录与翻译，该方法也称电穿孔转化法。,重组分子导入受体细胞,阳性脂质体及其介导的基因转染 DNA-磷酸钙转染法 DEAE葡聚糖转染法 显微注射,重组体的鉴定和分析,生物学方法：表型筛选、抗药性、缺陷基因的功能互补表型、噬菌斑的变化、报告基因 免疫学方法：放免、化学方法、显色反应 核酸杂交法：Southern, Nor

19、thern、菌落原位杂交 PCR技术 限制性酶切鉴定 测序,目的基因表达,原核细胞 真核细胞,原核生物与真核生物基因表达的主要差别,表达系统,原核细胞表达系统 大肠埃希氏菌表达系统 S30 T7 High Yield Protein Expression System 芽孢杆菌表达系统 真核细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统 AdEasy Adenoviral Vector System 昆虫细胞表达系统 Bac to Bac Expression System 酵母细胞表达系统,重组基因工程药物,目前已有许多种基因工程药物获准上市。 多肽、蛋白质、酶类药物，通过各式各样的基因表达系统实现了表

20、达，并获准上市。 重组基因工程药物的生产技术 上游技术：表达系统的选择；目的基因和载体的重组；重组载体导入宿主细胞；筛选含有表达载体的宿主细胞；通过调控表达载体的启动子，实现外源基因的表达。 下游技术：基因工程细胞的产业化培养，以获得外源基因的高效表达；产业化水平的表达产物的分离纯化，使表达产物的纯度和质量达到原料药规定的质量标准。,一、重组人胰岛素及其突变体,1923年，从动物中提取的胰岛素在美国上市。 1965年，我国完成结晶牛胰岛素全合成。 1979年，Rutter W等克隆了胰岛素基因。 1982年，第一个重组人胰岛素批准上市。 近年来，重组人胰岛素尤其是突变体产品，在市场销售份额逐年

21、递增。,一、重组人胰岛素及其突变体,概述 糖尿病属内分泌代谢疾病，初期表现为高血糖，并可继发引起脂肪和蛋白质代谢异常，如动脉粥样硬化，视网膜和肾脏病变，外周神经病变。 I型、II型糖尿病对胰岛素的依赖。 重组人胰岛素的制备方法 传统方法及其局限性。 包涵体表达 胰岛素原表达 酵母菌表达,一、重组人胰岛素及其突变体,重组人胰岛素的应用 控制糖尿病最有效的药物。 Aspart（门冬胰岛素，Novolog ）由丹麦诺和诺德公司研制生产，结构与人胰岛素的区别在于用天冬氨酸取代了B链28位上的脯氨酸。 APIDRA （赖谷胰岛素，Apidra ）安万特公司研制，以赖氨酸和谷氨酸分别取代了人胰岛素B3位的

22、天冬氨酸和B29位的赖氨酸。 Lispro （赖脯胰岛素 ，Humalog ）是第一个用于临床的速效胰岛素类似物,由美国礼来公司研制生产，将人胰岛素的B28与B29位的氨基酸对换。,二、重组人凝血因子,概述 血友病是遗传性凝血功能障碍引起的出血性疾病，80%的病友是A型：由凝血因子基因缺陷所致。 制备方法 传统方法及其局限性。 凝血因子的分子量较大，利用原核系统很难获得具有生物学活性的重组凝血因子。 因此，需要利用真核表达系统制备重组凝血因子，比如，在CHO、3T3等宿主细胞中制备。,二、重组人凝血因子,应用 补充外源性凝血因子，是临床治疗A型血友病的最主要途径。,三、重组人尿激酶与尿激酶原,

23、概述 尿激酶是一种纤溶酶原激活剂，能激活纤溶酶原转化成纤溶酶，使后者表现出纤溶的作用。 尿激酶原是尿激酶的前体。 制备方法 传统方法及其局限性。 由于尿激酶基因中含有较多的真核细胞偏爱密码子（相对于原核细胞来说是稀有密码子），在大肠埃希氏菌中的表达水平不高。 通过转换尿激酶基因中的真核细胞偏爱密码子，实现其在大肠埃希氏菌中的高水平表达。但产物以不溶的包涵体形式存在。 用真核表达系统表达：酵母，Sf9，CHO，Vero，Namalwa等。,三、重组人尿激酶与尿激酶原,应用 作为一种溶栓药物，在临床用于治疗心脑血管血栓，还可清除抑制因子对纤溶酶的抑制作用。,四、重组人生长激素,概述 生长激素是促进机体生长和代谢所必需的一种蛋白类激素。 制备方法 传统方法及其局限性。 由于生长激素是非糖基化修饰蛋白，多采用原核细胞表达系统进行制备，但易诱发机体产生抗体。 真核细胞表达系统表达：酵母，Sf9，CHO等。,四、重组人生长激素,应用 临床上，重组生长激素对由脑垂体生长激素分泌不足引起的矮小症具有疗效，也用于慢性肾衰竭以及其他原因引起的生长障碍、慢性肝脏疾病、烧伤及创伤等。,思考题,基因表达的基本类型有哪些？ 外源基因表达的概念？基本过程有哪些步骤？ 外源基因表达的系统主要有哪些？如何分类？ 基因工程在药学中是如何应用的？请举例说明。,