医学精品课件：脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2.ppt

1、器材准备,浓汁标本1支，粪便标本1支；碘酒棉球1瓶，酒精棉球 1瓶，眼科镊子2把；伊红美兰平板2个，营养琼脂平板5个。,自然界中的微生物,已经发现的微生物超过13万5千种，被认为非常危险的有600种，在人间传染的病原微生物380种。它们存在于地球的各个角落，从寒冷的极地到炎热的赤道，从4.2千米地层深处到85千米高空（芽孢）,均有它们的踪迹 。 空气、水、土壤、人体的体表以及与外界相通的腔道，均有不同种类和数量的微生物存在。,皮肤菌群示意图 ,存在于人类肠道的细菌超过800种，数量可达100万亿（1014），菌体重量11.5公斤（next slide ）,MICROBIAL LOCATOR M

2、AP OF THE BODY,人体谁当家作主？肠道菌群当家人做主!,医学微生物学实验 综合性实验三 Comprehensive Experiment NO:3,Environmental flora and Normal Bacterial flora on Skin 空气的细菌学检查P38 手指皮肤的细菌学检查P41,空气的细菌学检查,空气是人类赖以生存的环境之一，也是重要的疾病传播媒介。空气中的病原菌主要来自病人的排泄物和分泌物。这些污物，因风吹，以及人类日常活动，以气溶胶的形式悬浮于空中，使空气受到污染。 环境：不利于微生物生长。 种类：主要是病毒、真菌和细菌。在医院，公共场所致病菌的数

3、量比较多。 作用：可迅速全球传播。 危害：引起培养基、生物制品的污染，病原菌引起呼吸道传染病。,实验方法(自然沉降法):根据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培养基表面，培养以后，计数菌落形成单位（ colony forming unit ，CFU），可了解空气的污染情况。 实验步骤：每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、卫生间或任选地点），将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边，平板暴露于空气中15分钟，然后平板倒扣盖上，作标记。37温箱培养24小时，观察结果。 CFU/m3 50000NAT86N(直径7cm平板）。 N：平板上的菌落数。 A：平板面积(平方

4、厘米)。 T：采样时间(分钟)。,平板盖打开，盖朝下放在平板旁边，平板暴露15分钟。,空气的细菌学检查 暴露法（Exposure Method),手指皮肤的细菌学检查,在日常生活中，手的接触范围广，使用频率高，受到污染的机会也最多。一只外观比较“干净 ”的手，可携带10万个细菌、200多种病毒。经手传播的疾病，包括肠道传染病、部分呼吸道传染病、皮肤传染病，以及一切可经手传播的疾病。 常住菌：存在于皮肤表面、毛囊和皮脂腺。种类和数量比较恒定。附着在皮肤上比较牢固，用一般洗手方法，常不易去除。 暂住菌：存在于皮肤表面经常暴露的部位。暂住菌是外来的非正常菌群，种类和数量不定。引起人类致病的通常是暂住

5、菌。 实验设计：假设同一只手中间三个手指皮肤环境密切相关、细菌数量相当，分别作洗手、消毒前后细菌学检查。,常规的洗手方法（甲和丙操作）,将手充分浸湿，涂抹肥皂或洗涤液。 反复搓揉双手，搓揉时间不少于 30秒。 用流水冲洗干净，整个洗手过程不少于1分钟。 能有效地去除大多数暂住菌。,医学微生物学教学实验室标准洗手方法（乙丁操作）,用流动的水冲洗，将手充分浸湿，涂抹肥皂、洗涤液。 分别搓擦1015次。 保持双手低于肘部，流水冲洗一分钟以上。,1.掌心对掌心搓擦 2.手指交错掌心对手背搓擦 3.手指交错掌心对掌心搓擦,4.两手互握互搓指背 5.拇指在掌中转动搓擦 6.指尖在掌心中搓擦,手指皮肤的细菌

6、学检查,甲和乙、丙和丁共用1个平板,上:甲、丙常规洗手 下:乙、丁标准洗手,平板面朝下，三个手指分别在培养基表面触摸23厘米,第1格为洗手前， 第2格为洗手后， 第3格为消毒后， 第4格空白对照。,Isolation and identification of bacteria from clinical specimens (Pus & Stool) - workflow, culture media preparation, isolated culture of bacteria, pure culture of bacteria, morphological examination o

7、f bacteria, biochemisty, mobility, SCT & AST of bacteria, serologic test, results analysis paper writing,平板划线分离法 Streak Plate Method,借助于划线，将混杂的多种细菌，在平板表面分散成单个细菌，并固定在某一点上。培养以后细菌各自分裂繁殖，形成肉眼可见的细菌集团（单菌落）。 Colony:在固体培养基表面或基内，由单个细菌在局部位置不断增值，形成肉眼可见的细菌集团，称为单菌落。 Colony Forming Units:由单个或多个菌体，同种或不同种细菌，在固体培基上生

8、长繁殖堆积形成肉眼可见的细菌集落，称为菌落形成单位。 Lawn:在固体培养基表面，由许多菌落融合在一起形成一片密集的的细菌群落,称为菌苔 。 方法:见下一张幻灯片。 充分利用平板面积，不能划破琼脂。,划线示意图,分离结果,接种环烧灼灭菌。,取标本36ul。,平板采光，当看到平板表面象镜面有反光的时候，保持这个角度，划线时就能看清划线痕迹，以便控制划线。,接种环与平板呈3040度角，在平板表面上方，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于30条。,烧掉接种环上多余的标本。,转动平板，通过第一区57次，使接种环重新沾上少量细菌，同样的方法划第二区。,转动平板

9、，接种环通过第二区1次，划第三区。,转动平板，接种环通过第三区1次，划第四区。,划第五区。,每区划线不少于30条，整个平板划线不少于150条线。上下两条线重叠不影响分离结果。第一区划线不得超过1/5平板，,第一区占1/2平板，划线稀疏，没有典型单菌落。,第一区划线正确。第二区? 第三五区？,划线分离失败！,划线分离成功,平板上有许多典型单菌落可供挑选。,线段划得越密集，细菌分布前区密集后区稀疏，获得典型菌落越多。,甲 乙 4 丙 丁,甲 乙 3 丙 丁,甲 乙 2 丙 丁,甲 乙 1 丙 丁,甲 乙 5 丙 丁,甲 乙 8 丙 丁,甲 乙 7 丙 丁,甲 乙 6 丙 丁,甲 乙 10 丙 丁,

10、甲 乙 9 丙 丁,讲 台,左,右,甲脓汁标本(pus specimen)营养琼脂平板(nutrient agar plate) 乙脓汁标本(pus specimen) 营养琼脂平板(nutrient agar plate） 丙粪便标本(stool specimen)伊红美蓝(eosin methylene blue plate） 丁粪便标本(stool specimen) 伊红美蓝平板(EMB plate）,小组实验分工,杆1214cm,环直径24mm,绝缘柄10cm,接种环 inoculating loop,杆1214cm,针长46cm,接种针 inoculating needle,Ins

11、truments used to inoculate media: standard loop, needle, cotton-tipped swab, and pipette with safety bulb.,绝缘柄10cm,接种环（白金铒）烧灼灭菌 Flame Loop,使用前，将白金铒（白金丝、镍铬丝制成）直立火焰中，烧红灭菌（35秒钟冷却）。 使用后，先在火焰背面将把环上标本烤干，再烧灼灭菌，以免标本汽化，爆烈四溅，污染环境。 金属杆旋转通过火焰23次，杀灭表面微生物。,酒精灯无菌操作区,外焰:又称氧化焰,火焰呈淡紫色,温度较高。,无菌操作区:火焰周围1020cm范围内。,环面水平离

12、开液面：快速6ul,慢速2ul。,环面垂直离开液面：快速3ul,慢速1ul。,接种环取液体标本的方法,环直径3mm,无菌取材基本步骤 Transfer of Bacteria: Aseptic Technique, 在火焰旁边，左手斜持标本管下端，右手小指夹住试管棉塞上端，缓慢拔出棉塞并夹持之（棉塞下端不得接触到管口外任何物体）管口迅速通过火焰3次取标本管口通过火焰三次，塞棉塞。,Inoculating procedures,接种环和平板的握持方法 How to hold agar plate and inoculation loop,接种环接种平板一次，可产生几十个微生物气溶胶颗粒。 气溶胶

13、粒径100um沉降很快，50um在0.4s内扩散开，5um通过呼吸道直接到达肺泡。 Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。 实验时应坐稳，很专注，不分心，在火焰周围1020厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话，以免感染病原菌。,生物安全警告 BIOHAZARD,三级生物安全防护,思考题,为何取链球菌作为空气的卫生指标之一? 为什么金黄色葡萄球菌是医院内感染常见的重要病原菌? 为什么接种环使用前后必须烧灼灭菌？忽略了有什么危害? 做细菌培养时，平板为什么要倒置? 培养细菌的常用方法有哪些? 从临床标本中分离病原菌，应注意哪些事项?

14、,实验内容,空气的细菌学检查P38 营养琼脂平板(1组1个） 手指皮肤的细菌学检查P41 营养琼脂平板(2人1个 划分8格） 平板划线分离法P8 甲脓汁标本营养琼脂平板 乙脓汁标本营养琼脂平板 丙粪便标本伊红美蓝平板 丁粪便标本伊红美蓝平板,test tube rack inoculating needle , inoculating loop ； oil base pen , lighter.,power socket test tube rack Alcohol burner kidney basin,实验器材 整齐有序,微生物学器材柜-2（边台东侧中段）,酒精棉球,碘酒棉球,镊子,电炉、石棉网,手套,消毒器材收拾入柜 依次摆整齐 ,常用器材摆放顺序：电源插座试管架酒精灯污物盘。 试管架上器材：靠近插座一侧第1列放置接种针,第2列放置 接种环，另一侧中间两行放置油性笔和打火机。,器材使用后，必须放回原处，依次摆整齐。,