1、酵母双杂交体系酵母双杂交体系Yeast two-hybrid system酵母双杂交酵母双杂交(yeast two hybrid)技术是利技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用的技术作用的技术.背景知识背景知识真核生物转录起始前区域结构真核生物转录起始前区域结构:-25bp区有：区有：TATA 序列序列 称为称为Hogness盒或盒或TATA box，为启动子核，为启动子核心序列。心序列。上游更远处上游更远处 增强子增强子统称顺式作用元件统称顺式作用元件转录因子转录因子能直接或间接辨认和结合上游区段能直接或间接辨认和结合上游区段DNA的蛋白质的蛋白
2、质-反式作用因子反式作用因子.其中能直接或间接与其中能直接或间接与RNA聚合酶结合的聚合酶结合的称为转录因子称为转录因子(TF).相应于相应于RNA聚合酶聚合酶的转录因子为的转录因子为TF,真核生物的真核生物的TF又分为又分为TF A与与TF B真核生物转录起始前复合物真核生物转录起始前复合物TFD识别识别TATATFD-A-B-DNA复合体复合体TFB为桥梁并提供结合表面为桥梁并提供结合表面,促使促使TFF-RNA pol复合结构进入启动子核复合结构进入启动子核心区心区TATA.TFE的的ATPase分解分解ATP,解开解开DNA双双螺旋螺旋.TFH进入完成转录起始前复合物进入完成转录起始前
3、复合物(PIC)启动合成启动合成RNA第一个碱基第一个碱基.真核转录因子的结构域真核转录因子的结构域两个结构域两个结构域lDNA结合结构域结合结构域(DNA-binding domain，BD)l一个或多个与其他调控蛋白相互作用的转录激一个或多个与其他调控蛋白相互作用的转录激活结构域活结构域(activation domain，AD)酵母转录因子酵母转录因子GAL4结构特点结构特点 GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的包括两个彼此分离的但功能必需的结构域结构域.两结构两结构域域：DNA结合结合域域 转录激活转录激活域域 特点：结构上可分开、功能上相互独立特点：结构上可分开、功能上相互独立基本
4、原理基本原理DNA结合结合域域（DNA-BD）：）：N端端1-147氨基酸氨基酸转录激活转录激活域域（AD）：）：C端端786-881氨基氨基酸酸DNA-BD：识别：识别GAL4效应基因上游的效应基因上游的激活序列（激活序列（UAS），并与之结合，并与之结合AD：通过同转录机制：通过同转录机制(transcription machinery)的其它成分之间的结合以启的其它成分之间的结合以启动上游激活序列（动上游激活序列（UAS）下游的基因转录。）下游的基因转录。用用DNA重组技术，将重组技术，将DNA-BD和和AD分分开，并放在同一宿主细胞中表达。开，并放在同一宿主细胞中表达。将编码将编码DN
5、A-BD的基因与已知蛋白质的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码将编码AD的基因和的基因和cDNA文库的基文库的基因构建在因构建在AD-LIBRARY表达载体上。表达载体上。产生的产生的GAL4 DNA-BD和和AD多肽多肽不直接发生相互作用，不能激活相关的效不直接发生相互作用，不能激活相关的效应基因进行转录应基因进行转录同时用上述两种载体转化改造后的酵同时用上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组母，这种改造后的酵母细胞的
6、基因组中不能产生中不能产生GAL4。GAL1 UAS（上游激活序列）（上游激活序列）启动子启动子Lac Z(报告基因报告基因)DNA-BD蛋白质蛋白质XGAL1 UAS（上游激活序列）（上游激活序列）启动子启动子Lac Z(报告基因报告基因)AD蛋白质蛋白质YGAL1 UAS（上游激活序列）启动子Lac Z(报告基因)缺陷型宿主菌株缺陷型宿主菌株常见的有常见的有SF562和和HF7c.特点：特点：无表达无表达GAL4转录激活因子的能力转录激活因子的能力载体载体-穿梭质粒穿梭质粒pGBT9,又称又称DNA-BD质粒载体。靶基质粒载体。靶基因插入可与因插入可与GAL4-BD形成融合蛋白形成融合蛋白
7、。pGAD424，又称，又称AD质粒载体。靶基因质粒载体。靶基因插入可与插入可与GAL4-AD形成融合蛋白形成融合蛋白。二者均可在大肠杆菌和酿酒酵母中自主复二者均可在大肠杆菌和酿酒酵母中自主复制。制。两种融合蛋白可在酵母中高表达。在核定两种融合蛋白可在酵母中高表达。在核定位序列作用下，进入酵母细胞核内。位序列作用下，进入酵母细胞核内。（ADH1:醇脱氢酶醇脱氢酶1）实验程序实验程序1 分别重组两种穿梭质粒载体。分别重组两种穿梭质粒载体。2 分别导入分别导入E.coli培养。培养。3 分别提取两种质粒。分别提取两种质粒。4 转化酵母菌转化酵母菌5 筛选阳性克隆筛选阳性克隆应用应用-蛋白质相互作用蛋白质相互作用筛选单抗筛选单抗蛋白质蛋白质-蛋白质相互作用蛋白质相互作用筛选酶抑制剂筛选酶抑制剂
