授课用高分辨率溶解曲线资料课件.ppt

1、高分辨率溶解曲线高分辨率溶解曲线内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变（mutation scanning）基因分型基因分型（Mutation Genotyping）小片段+内标法（Small Amplicon Genotyping）非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe）SSR分析分析 检测甲基化检测甲基化 HRM仪器High Resolution DNA Melting（HRM)是基于有序列变化的是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的之间微弱的

2、Tm值差异，通过值差异，通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：PCRTube 1Tube 2Tube 3Wild typeHomozygoteHeterozygoteLightScanner突变检测原理突变检测原理Lightscanner高分辨溶解曲线结果高分辨溶解曲线结果Saturating dyeSaturating dyeLC Green plus LC Green plus 高分辨溶解曲线专用荧光染料高分辨溶解曲线专用荧光染料内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 高分辨熔解曲线在蚕的遗传

3、育种中的应用 筛查突变筛查突变（mutation scanning）基因分型基因分型（Mutation Genotyping）小片段+内标法（Small Amplicon Genotyping）非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe）SSR分析分析 检测甲基化检测甲基化 HRM仪器未知未知SNPSNP扫描扫描等对北京油鸡CAPN1基因外显子进行扫描，筛查其潜在SNPs。Bernhard J.HoWnger Hai-Chun Jing Kim E.Hammond-Kosack Kostya Kanyuka(Barley Application)Th

4、eor Appl Genet()119:851865数据来自英国洛桑农业实验站数据来自英国洛桑农业实验站Bernhard等对Barley的eukaryotic translationinitiation factor 4E(eIF4E)gene基因外显子进行突变扫描结果基因外显子进行突变扫描结果高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用1 Probe 1 SNP,All Possible SNPsApplication og high-resolution DNA melting for genotyping and variant scanning of diploid and autotetrapl

5、oid potato Mol Breeding()Application og high-resolution DNA melting for genotyping and variant scanning of diploid and autotetraploid potato Mol Breeding()7%（400bp）Heterozygote高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用2 Probes,2 SNPs,2 Amplicons-HFE 检测甲基化时间大约2小时（包含试剂准备）Rosario Muleo（）等用HRM方法对三个品种的SSR DCA4进行分析，DCA4的等位基因有131

6、bp的重复序列，杂合等位基因的序列为131-133bp，分析结果如图8所示，HRM曲线可以将纯合样品和杂合样品明显的区分，其中一个等位基因只相差2bp。小片段+内标法（Small Amplicon Genotyping）Hammond-Kosack Kostya KanyukaLightScanner突变检测原理高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe）检测甲基化内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变（mutat

7、ion scanning）基因分型基因分型（Mutation Genotyping）小片段+内标法（Small Amplicon Genotyping）非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe）SSR分析分析 检测甲基化检测甲基化 HRM仪器Small Amplicon Genotyping扩增小片段直接进行基因型鉴定扩增小片段直接进行基因型鉴定使用已知Tm值的双链DNA做温度内标，低温内标Tm(61),高温内标Tm(92)内标能够实现96/384孔板的温度均一矫正。PCR片段的Tm值范围：70-88 优点：不需要探针，直接利用PCR产物针对已知突

8、变位点进行基因分型为何要使用温度内标为何要使用温度内标等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表纯合型CC和TT。内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变（mutation scanning）基因分型基因分型（Mutation Genotyping）小片段+内标法（Small Amplicon Genotyping）非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe）SS

9、R分析分析 检测甲基化检测甲基化 HRM仪器Class 1 C:T,G:AClass 2 C:A,G:TClass 3 C:GClass 4 A:T重复性LightScanner重复性100%Genome52:252-260Mix RR:Rr by 1:1 RRRr1 Probe 1 SNP,All Possible SNPs在PCR反应前加入 LCGreen 荧光染料检测未知及已知突变准确性100%、特异性92.Class 1 C:T,G:ALightScanner 96/384小片段+内标法（Small Amplicon Genotyping）Genome52:252-2602 Probe

10、s,2 SNPs,2 Amplicons-HFERosario Muleo（）等用HRM方法对三个品种的SSR DCA4进行分析，DCA4的等位基因有131bp的重复序列，杂合等位基因的序列为131-133bp，分析结果如图8所示，HRM曲线可以将纯合样品和杂合样品明显的区分，其中一个等位基因只相差2bp。Mutation Scanning高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用7%（400bp）David De，Yong Song at el.Application og high-resolution DNA melting for genotyping and variant scannin

11、g of diploid and autotetraploid potato Mol Breeding()25:6790 rrRRRrMix Rr:rr by 1:1 RrrrMix RR:Rr by 1:1 RRRr内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变（mutation scanning）基因分型基因分型（Mutation Genotyping）小片段+内标法（Small Amplicon Genotyping）非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，Lun

12、aProbe）SSR分析 检测甲基化检测甲基化 HRM仪器Rosario Muleo（）等用HRM方法对三个品种的SSR DCA4进行分析，DCA4的等位基因有131bp的重复序列，杂合等位基因的序列为131-133bp，分析结果如图8所示，HRM曲线可以将纯合样品和杂合样品明显的区分，其中一个等位基因只相差2bp。三种颜色（浅灰，深灰、黑色）表明3种不同的品种。Rosario Muleo等得出结论：HRM是一种快速、重复性高、成本低，操作简单，且可以应用于其他物种的SNP检测及SSR基因分型的方法。Rosario Muleo,Marir Chiara Colao,Dario Miano at

13、 el.Genome52:252-260内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 筛查突变筛查突变（mutation scanning）基因分型基因分型（Mutation Genotyping）小片段+内标法（Small Amplicon Genotyping）非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe）SSR分析分析 检测甲基化 HRM仪器内容提示内容提示 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用

14、 筛查突变筛查突变（mutation scanning）基因分型基因分型（Mutation Genotyping）小片段+内标法（Small Amplicon Genotyping）非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe）SSR分析分析 检测甲基化检测甲基化HRM仪器2005LightScanner 96/38496/384 孔板孔板8 分钟分钟/板板2-6 秒秒/样品样品温度均一性：温度均一性：oC 数据采集速度：大于数据采集速度：大于100pts/秒秒 升温速度：升温速度：oC/秒秒 LS32 32 样品转盘样品转盘,玻璃毛细玻璃毛细管管HR

15、M 检测检测 60 分钟内完成定量分钟内完成定量 PCR 和和 HRM 检测检测 HRM检测升温速度可检测升温速度可以在以在 0.05 oC/秒之间秒之间调节调节在升温速度小于在升温速度小于/秒秒时，温度均一性：时，温度均一性：oC 数据采集速度：数据采集速度：20pts/秒秒400pts/秒（与升温秒（与升温速度有关）速度有关）oC/秒秒 升温速度升温速度=67 pts/oC/秒秒 升温速度升温速度=400 pts/LunaProbesLunaProbes非标记探针基因分型非标记探针基因分型未知未知SNPSNP扫描扫描Small AmpliconSmall Amplicon小片段小片段基因分

16、型基因分型HRM分析流程分析流程在PCR反应前加入 LCGreen 荧光染料时间大约时间大约2 2小时（包含试剂准备）小时（包含试剂准备）在LightScanner上进行高分辨溶解曲线分析大约需要大约需要5-10 5-10 分钟分钟数据分析和处理大约需要大约需要5-10 5-10 分钟分钟PCR产物可以直接进行下游的测序分析等（如需要）大约需要大约需要30-6030-60分钟分钟LightScanner适于适于SNP分析分析速度、通量LightScanner 510分钟完成96/384孔板的PCR产物检测，20000个SNP/天 可检测未知、已知突变，对已知突变进行Genotyping检测未知及已知突变准确性100%、特异性92.7%（400bp）重复性LightScanner重复性100%操作LightScanner只需将PCR产物（96/384孔板）放入仪器内便可，软件自动基因分型，PCR产物不需要处理谢谢！