动物细胞培养制药工艺课件.pptx

1、动物细胞的一般特征动物细胞的一般特征 昆虫表达系统昆虫表达系统 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统第一节第一节 制药动物细胞的表达与特征制药动物细胞的表达与特征动物细胞培养动物细胞的表达与特征 没有细胞壁没有细胞壁 细胞膜细胞膜 细胞质细胞质 细胞核细胞核 细胞器细胞器动物细胞的一般特征动物细胞的一般特征1、结构与功能、结构与功能 动物细胞培养动物细胞的表达与特征 葡萄糖和谷氨酰胺：能量和合成代谢的前提葡萄糖和谷氨酰胺：能量和合成代谢的前提 葡萄糖代谢：糖酵解为主，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌葡萄糖代谢：糖酵解为主，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到细胞外并在培养液中积累；经到细胞外并在培养液中

2、积累；经TCA循环，彻底氧化产生循环，彻底氧化产生CO2和和H2O。一小部分为戊糖磷酸途径，生成四、五、七碳。一小部分为戊糖磷酸途径，生成四、五、七碳糖和糖和NADPH 中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢 葡萄糖代谢旺盛，产生大量的乳酸，对细胞有毒性葡萄糖代谢旺盛，产生大量的乳酸，对细胞有毒性 葡萄糖限制：增加谷氨酰胺消耗以补偿，反之亦然葡萄糖限制：增加谷氨酰胺消耗以补偿，反之亦然2、细胞代谢特性、细胞代谢特性糖代谢糖代谢 动物细胞培养动物细胞的表达与特征 谷氨酰胺：脱氨、转氨等，合成其它谷氨酰胺：脱氨、转氨等，合成其它非必须非必须氨基酸氨

3、基酸 离体动物细胞，转氨是主要代谢途径；谷氨酰胺与丙离体动物细胞，转氨是主要代谢途径；谷氨酰胺与丙酮酸发生转氨作用，生成丙氨酸，进入培养液并积累。酮酸发生转氨作用，生成丙氨酸，进入培养液并积累。脱氨产生的氨，对细胞有毒性。脱氨产生的氨，对细胞有毒性。谷氨酰胺是动物细胞的氮源，受限制时，通过增加其谷氨酰胺是动物细胞的氮源，受限制时，通过增加其它氨基酸的消耗得以补偿。它氨基酸的消耗得以补偿。流加葡萄糖或谷氨酰胺，控制整个代谢过程，避免有流加葡萄糖或谷氨酰胺，控制整个代谢过程，避免有毒废物积累。毒废物积累。2、细胞代谢特性、细胞代谢特性氨基酸代谢氨基酸代谢 动物细胞培养动物细胞的表达与特征 蛋白质合

4、成场所：蛋白质合成场所：糖基化场所：内质网合成各种糖类，在粗糙内质网腔糖基化场所：内质网合成各种糖类，在粗糙内质网腔内和高尔基体进行加工修饰。内和高尔基体进行加工修饰。不同细胞系糖基化特征不同，选择适宜细胞系。不同细胞系糖基化特征不同，选择适宜细胞系。对于分泌型蛋白，分泌泡与细胞膜融合，释放对于分泌型蛋白，分泌泡与细胞膜融合，释放 到胞外，到胞外，完成了蛋白质的分泌表达。完成了蛋白质的分泌表达。3、蛋白质糖基化与分泌表达、蛋白质糖基化与分泌表达 动物细胞培养动物细胞的表达与特征 昆虫杆状病毒如核多角体病毒可携带外源基因，感染昆虫杆状病毒如核多角体病毒可携带外源基因，感染昆虫细胞或幼虫（宿主），

5、高水平表达外源蛋白质。昆虫细胞或幼虫（宿主），高水平表达外源蛋白质。研究进展研究进展 1983年，苜蓿尺蠖核多角体病毒年，苜蓿尺蠖核多角体病毒秋黏虫细胞表达系统秋黏虫细胞表达系统 1984年，家蚕核多角体病毒年，家蚕核多角体病毒家蚕幼虫表达系统家蚕幼虫表达系统 昆虫表达系统昆虫表达系统动物细胞培养动物细胞的表达与特征 安全：杆状病毒无致病性，产品安全性接受安全：杆状病毒无致病性，产品安全性接受FDA认可认可 易饲养：家蚕发育快、遗传背景清楚易饲养：家蚕发育快、遗传背景清楚 高量表达：外源基因超量表达；不连续且时间短高量表达：外源基因超量表达；不连续且时间短 高效表达：对外源基因有很大的容量（可

6、插入高效表达：对外源基因有很大的容量（可插入100kb的的DNA）可作为重组病毒的选择性标记，是因为外源基因的插可作为重组病毒的选择性标记，是因为外源基因的插入并不影响病毒的增殖，却丧失合成多角体的能力。入并不影响病毒的增殖，却丧失合成多角体的能力。翻译后加工：昆虫细胞能进行一系列翻译后的加工，翻译后加工：昆虫细胞能进行一系列翻译后的加工，与哺乳动物不同与哺乳动物不同 重组率低：筛选困难、周期长，需要重组率低：筛选困难、周期长，需要4-10d优点与不足优点与不足 动物细胞培养动物细胞的表达与特征 重组率低、筛选困难、周期长，需要重组率低、筛选困难、周期长，需要4-10d 研究开发的主要方向：有

7、效的病毒表达系统研究开发的主要方向：有效的病毒表达系统 决定基因表达时期启动子，无血清培养昆虫细胞系决定基因表达时期启动子，无血清培养昆虫细胞系 动物细胞培养动物细胞的表达与特征 基于细胞来源：原代细胞、传代细胞基于细胞来源：原代细胞、传代细胞 基于细胞寿命：有限细胞系、无限细胞系基于细胞寿命：有限细胞系、无限细胞系 基于细胞的染色体数目：二倍体细胞系、异倍体细胞系基于细胞的染色体数目：二倍体细胞系、异倍体细胞系 基于获得方式：工程细胞系、癌变细胞系基于获得方式：工程细胞系、癌变细胞系 基于生长特性：贴壁依赖性、非贴壁依赖性基于生长特性：贴壁依赖性、非贴壁依赖性1、细胞系的分类、细胞系的分类

8、动物细胞培养动物细胞的表达与特征 哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统 概念：从动物体内直接分离得到的细胞。概念：从动物体内直接分离得到的细胞。特点：生长分裂不旺盛，与体内细胞相似特点：生长分裂不旺盛，与体内细胞相似 应用：药物检测实验，药理研究。应用：药物检测实验，药理研究。生产药品：鸡胚细胞，兔或鼠肾细胞、淋巴细胞。生产药品：鸡胚细胞，兔或鼠肾细胞、淋巴细胞。1）原代细胞）原代细胞动物细胞培养动物细胞的表达与特征 概念：原代细胞转接后培养的细胞。概念：原代细胞转接后培养的细胞。特点：细胞分裂增殖旺盛，二倍体核型。特点：细胞分裂增殖旺盛，二倍体核型。二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、

9、克隆、纯二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆、纯 化后，获得具一定化后，获得具一定特征特征的细胞系。的细胞系。药品生产：药品生产：WI38、MRC5等。等。2）传代细胞）传代细胞动物细胞培养动物细胞的表达与特征 概念：是生长和寿命有限的细胞，经过若干传代培养概念：是生长和寿命有限的细胞，经过若干传代培养后失去增殖能力，老化死亡。后失去增殖能力，老化死亡。特点：有限生长，无致瘤性，有接触抑制性特点：有限生长，无致瘤性，有接触抑制性 举例：举例：WI-38、MRC-5等用于药品生产，曾经广泛使等用于药品生产，曾经广泛使用用 寿命：取决于细胞来源的物种和年龄、器官。人细胞寿命：取决于细胞来源的

10、物种和年龄、器官。人细胞最高培养次数最高培养次数50-60代。胚成纤维细胞：人，代。胚成纤维细胞：人，50代；鸡胚代；鸡胚30代；小鼠，代；小鼠，8代。代。3）有限细胞系）有限细胞系 动物细胞培养动物细胞的表达与特征 概念：是寿命和活性不受传代次数影响的细胞系，可概念：是寿命和活性不受传代次数影响的细胞系，可连续培养连续培养 特点：没有接触抑制性，对培养条件和营养因子要求特点：没有接触抑制性，对培养条件和营养因子要求低，倍增时间短，适合制药工业生产低，倍增时间短，适合制药工业生产 理想的药物生产细胞系理想的药物生产细胞系4）无限细胞系）无限细胞系 动物细胞培养动物细胞的表达与特征 概念：采用基

11、因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行了修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。方法：正常细胞异倍体化；融合或重组。5）工程细胞系动物细胞培养动物细胞的表达与特征 概念：采用基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行概念：采用基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行了修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细了修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。胞系。方法：正常细胞异倍体化；融合或重组。方法：正常细胞异倍体化；融合或重组。5）工程细胞系）工程细胞系 概念：染色体的断裂变成异倍体，失去了正常细胞的概念：染色体的断裂变成异倍体，失去了正常细胞的特点，而获得了无限增殖的能力。特点，

12、而获得了无限增殖的能力。特点：特点：长期培养，倍增时间短，对培养条件和生长因子等长期培养，倍增时间短，对培养条件和生长因子等要求较低，适于大规模工业化生产。要求较低，适于大规模工业化生产。6）转化细胞系）转化细胞系动物细胞培养动物细胞的表达与特征 Namalwa：类淋巴母细胞，非整倍体，悬浮生长。英：类淋巴母细胞，非整倍体，悬浮生长。英国国Wellcome公司公司Sendai病毒诱导，大规模生产病毒诱导，大规模生产a-a-干扰素。干扰素。WI-38：二倍体成纤维细胞系，寿命有限：二倍体成纤维细胞系，寿命有限。贴壁生长，。贴壁生长，对许多病毒敏感，第一个被用于制备疫苗对许多病毒敏感，第一个被用于

13、制备疫苗 MRC-5：二倍体成纤维细胞系，生长较：二倍体成纤维细胞系，生长较WI-38快，对快，对逆境有一定的抗性，用于制备疫苗逆境有一定的抗性，用于制备疫苗2、生产用的细胞系、生产用的细胞系 1）人源细胞系）人源细胞系 动物细胞培养动物细胞的表达与特征 CHO细胞：细胞：Chinese hamster ovary 特点：贴壁生长，也可悬浮培养，对剪切力和渗透压特点：贴壁生长，也可悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍耐能力有较高的忍耐能力 最为普遍和成熟表达糖基化蛋白质药物的细胞。多种最为普遍和成熟表达糖基化蛋白质药物的细胞。多种衍生突变株，高表达。衍生突变株，高表达。药物：药物：tPA、EP

14、O、HBsAg、凝血因子、凝血因子、DNA 酶酶I等等2）哺乳动物细胞系）哺乳动物细胞系 动物细胞培养动物细胞的表达与特征 骨髓瘤细胞与产生抗体的骨髓瘤细胞与产生抗体的B细胞融合而构成的细胞细胞融合而构成的细胞 特点：无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和特点：无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生长，大量分泌和高效表达。生长，大量分泌和高效表达。单克隆抗体的制备。单克隆抗体的制备。3）杂交瘤细胞系）杂交瘤细胞系 动物细胞培养动物细胞的表达与特征 病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒 质粒穿梭载体：由质粒和表达筛选盒组成质粒穿梭

15、载体：由质粒和表达筛选盒组成 动物细胞中的筛选功能动物细胞中的筛选功能3、动物细胞的表达载体、动物细胞的表达载体 动物细胞培养动物细胞的表达与特征 对培养条件要求苛刻：无细胞壁，对周围环境十分敏对培养条件要求苛刻：无细胞壁，对周围环境十分敏感，理化因素易受伤害感，理化因素易受伤害 对培养基要求高：完全异养，容易利用，相对低分子对培养基要求高：完全异养，容易利用，相对低分子量的营养物量的营养物 产物：接近天然结构的活性分子，产品与天然的产物产物：接近天然结构的活性分子，产品与天然的产物一致；有潜在的血源性污染的危险一致；有潜在的血源性污染的危险 工艺：难度大、产量低、成本高；分离纯化简单工艺：难

16、度大、产量低、成本高；分离纯化简单4、表达特点、表达特点 动物细胞培养动物细胞的表达与特征第十七章第十七章 动物细胞培养动物细胞培养 制药工艺制药工艺第一节第一节 制药动物细胞的表达与特征制药动物细胞的表达与特征第二节第二节 基因工程动物细胞系的构建基因工程动物细胞系的构建第三节第三节 动物细胞培养基制备动物细胞培养基制备第四节第四节 动物细胞培养技术动物细胞培养技术第五节第五节 培养过程检测与工艺控制培养过程检测与工艺控制表达载体的设计与构建表达载体的设计与构建 转染与培养转染与培养 筛选与鉴定筛选与鉴定第二节第二节 基因工程动物细胞系的构建基因工程动物细胞系的构建动物细胞培养基因工程动物细

17、胞系动物细胞培养基因工程动物细胞系 病毒载体：病毒载体：牛痘病毒：构建多价疫苗牛痘病毒：构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒：基因治疗腺病毒、逆转录病毒：基因治疗 杆状病毒：外源基因表达（昆虫）杆状病毒：外源基因表达（昆虫）质粒载体：穿梭载体，细菌体内扩增，在动物细胞中质粒载体：穿梭载体，细菌体内扩增，在动物细胞中表达。表达。1、载体类型、载体类型 表达载体的设计与构建表达载体的设计与构建动物细胞培养基因工程动物细胞系动物细胞培养基因工程动物细胞系 基本过程：与基因工程微生物相同 区别：表达原件，启动子、终止子、增强子、选择标记2、启动子和复制子 动物细胞培养基因工程动物细胞系动物细胞培养基因工程

18、动物细胞系 基本过程：与基因工程微生物相同 区别：表达原件，启动子、终止子、增强子、选择标记2、启动子和复制子、启动子和复制子 基本过程：与基因工程微生物相同基本过程：与基因工程微生物相同 区别：表达原件，启动子、终止子、增强子、选择标记区别：表达原件，启动子、终止子、增强子、选择标记 转录起始序列和转录起始序列和ATG起始密码起始密码ATG的的5端约端约15bp范围侧翼序列内不含碱基范围侧翼序列内不含碱基T在在-3，-6和和-9 位置，偏好位置，偏好G碱基碱基在在-3，-6和和-9 位置，整个侧翼序列区偏好位置，整个侧翼序列区偏好C碱基碱基3、转录起始序列、转录起始序列 动物细胞培养基因工程

19、动物细胞系动物细胞培养基因工程动物细胞系4、终止子 动物细胞培养基因工程动物细胞系动物细胞培养基因工程动物细胞系 终止密码子：终止密码子：T(U)AA，T(U)AG，T(U)GA PolyA信号序列：不宜太长，避免能量过度消耗信号序列：不宜太长，避免能量过度消耗常用：常用：SV40 PolyA(131)、BGH的的PolyA（225bp）终止序列：加尾信号序列终止序列：加尾信号序列AA T(U)AAA或连续的终止密码或连续的终止密码 UGA、UAA和和UAG，防止转录通读，使转录在正确位点结束。，防止转录通读，使转录在正确位点结束。增强子：在转录起始点上游或下游使用，有利于提高外源基增强子：在

20、转录起始点上游或下游使用，有利于提高外源基 因的转录水平。因的转录水平。4、终止子、终止子 转染指真核细胞由于外源转染指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过掺入而获得新的遗传标志的过程程 一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。转染与培养转染与培养动物细胞培养基因工程动物细胞系动物细胞培养基因工程动物细胞系 外源外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达可存在多个拷贝数，产生高水平的表达。特点特点：只持续几天：只持续几天 转染与培养转染与培养动物

21、细胞培养基因工程动物细胞系动物细胞培养基因工程动物细胞系1、瞬时转染、瞬时转染 外源外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（体（episome）存在的表达）存在的表达。特点特点：持续时间长。：持续时间长。转染与培养转染与培养动物细胞培养基因工程动物细胞系动物细胞培养基因工程动物细胞系2、稳定转染、稳定转染 动物细胞培养转染方法转染方法原原 理理应应 用用特特 点点DEAE-葡聚糖葡聚糖法法带正电的带正电的DEAE-葡聚糖与带负电葡聚糖与带负电的核酸磷酸骨架相互作用形的核酸磷酸骨架相互作用形成复合物成复合物,通过细胞内吞作用通过细胞内

22、吞作用进入细胞进入细胞瞬时转染瞬时转染相对简便相对简便,结果可重复结果可重复,但对细胞但对细胞有一定的毒副作用有一定的毒副作用,转染时需转染时需去除血清去除血清磷酸钙法磷酸钙法磷酸钙磷酸钙-DNA 复合物吸附于细胞复合物吸附于细胞膜膜,被细胞内吞稳定转染被细胞内吞稳定转染,瞬时转染瞬时转染操作简便操作简便,但重复性差但重复性差,不适用于不适用于原代细胞及某些培养细胞原代细胞及某些培养细胞阳离子脂质体阳离子脂质体法法带正电的脂质体与带负电的核酸带正电的脂质体与带负电的核酸磷酸骨架形成复合物磷酸骨架形成复合物,被细胞被细胞内吞内吞稳定转染、稳定转染、瞬时转染瞬时转染转染效率高，重复性好，但转染转染

23、效率高，重复性好，但转染时需去除血清，转染效果随时需去除血清，转染效果随细胞类型变化大细胞类型变化大逆转录病毒介逆转录病毒介导法导法通过感染宿主细胞将外源基因整通过感染宿主细胞将外源基因整合到染色体中合到染色体中稳定转染稳定转染用于难转染的细胞，如原代细胞，用于难转染的细胞，如原代细胞，但携带基因不能太大，操作但携带基因不能太大，操作复杂，耗时。复杂，耗时。腺病毒介导法腺病毒介导法通过感染宿主细胞将外源基因整通过感染宿主细胞将外源基因整合到染色体中合到染色体中瞬时转染特瞬时转染特定宿主细定宿主细胞胞可用于难转染的细胞可用于难转染的细胞电穿孔法电穿孔法高脉冲电压破坏细胞膜电位，高脉冲电压破坏细胞

24、膜电位，DNA 通过膜的小孔导入通过膜的小孔导入稳定转染、稳定转染、瞬时转染瞬时转染适用于所有细胞，但细胞致死率适用于所有细胞，但细胞致死率高，高，DNA 和细胞用量大。和细胞用量大。基因枪法将基因枪法将DNA 用显微重金属颗粒沉淀用显微重金属颗粒沉淀,再再将包被好的颗粒用弹道装置将包被好的颗粒用弹道装置射入细胞射入细胞瞬时转染瞬时转染可用于人的表皮细胞、成纤维细可用于人的表皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞系及原代细胞胞、淋巴细胞系及原代细胞显微注射法显微注射法通过显微操作将通过显微操作将DNA 直接注入靶直接注入靶细胞核稳定转染细胞核稳定转染瞬时转染瞬时转染转染细胞数有限，多用于基因工转染细胞数

25、有限，多用于基因工程改造程改造 外源基因转染方法外源基因转染方法：化学化学、物理和生物的方法、物理和生物的方法人工脂质体法原理：人工脂质体法原理：动物细胞培养基因工程动物细胞系动物细胞培养基因工程动物细胞系脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。最初，人们只是运用脂质体模拟生物膜，研究人工生物膜。最初，人们只是运用脂质体模拟生物膜，研究膜的构造及功能，从而发现了膜的融合及内吞作用，因而可膜的构造及功能，从而发现了膜的融合及内吞作用，因而可用作外源物质进入细胞的载体。用作外源物质进入细胞的载体。阳离子脂质体表面带正电荷，能与

26、核酸的磷酸根通过静电阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将作用将DNA分子包裹人内，形成分子包裹人内，形成DNA一脂复合体，也能被一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，将作用，偶尔也通过直接渗透作用，将DNA传递进入细胞，形传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体，其中一小部分成包涵体或进入溶酶体，其中一小部分DNA能从包涵体内释能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。外源基因转染方法外源基因转染方

27、法：化学化学、物理和生物的方法、物理和生物的方法人工脂质体法方法：人工脂质体法方法：动物细胞培养基因工程动物细胞系动物细胞培养基因工程动物细胞系细胞制备：细胞制备：105的培养平板，的培养平板，CO2培养箱培养箱37培养培养20h。脂质体制备：脂质体制备：DNA与脂质体混匀，室温下与脂质体混匀，室温下10min。转染培养：转染培养：培养基培养基DNA脂质体脂质体培养培养6-7h弃去培养基弃去培养基DMSO无血清培养无血清培养基洗涤基洗涤2-3次次 血清培血清培 养养 基基 扩增培养：非选择性培养基，扩增培养：非选择性培养基，1-2d，转染，转染DNA表达表达 筛选培养：筛选培养：1:15选择性

28、培养基，选择性培养基，2-4d更换培养基，筛选阳性更换培养基，筛选阳性菌株菌株 2-3周，获得单克隆细胞集落周，获得单克隆细胞集落 鉴鉴 定：对独立集落进行稳定性、表达量、生物活性等鉴定。定：对独立集落进行稳定性、表达量、生物活性等鉴定。筛选与鉴定筛选与鉴定动物细胞培养基因工程动物细胞系动物细胞培养基因工程动物细胞系第十七章第十七章 动物细胞培养动物细胞培养 制药工艺制药工艺第一节第一节 制药动物细胞的表达与特征制药动物细胞的表达与特征第二节第二节 基因工程动物细胞系的构建基因工程动物细胞系的构建第三节第三节 动物细胞培养基制备动物细胞培养基制备第四节第四节 动物细胞培养技术动物细胞培养技术第

29、五节第五节 培养过程检测与工艺控制培养过程检测与工艺控制动物细胞培养细胞培养基制备第三节第三节 动物细胞培养基制备动物细胞培养基制备培养基组成成分培养基组成成分 培养基种类培养基种类 培养基质量控制培养基质量控制糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类、生长因子及激素、结糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类、生长因子及激素、结合蛋白质、贴附与伸展因子及其它附加成分等。合蛋白质、贴附与伸展因子及其它附加成分等。培养基组成成分培养基组成成分动物细胞对培养基的要求高，不同细胞系的要求也不尽相同，动物细胞对培养基的要求高，不同细胞系的要求也不尽相同，要尽可能提供与体内生活条件接近的培养环境。要尽可能提供与体内

30、生活条件接近的培养环境。动物细胞培养细胞培养基制备 糖类提供细胞生长的碳源和能源，分解后释放出能量糖类提供细胞生长的碳源和能源，分解后释放出能量ATP。不同细胞对葡萄糖利用相似，在无氧条件下还产生乳酸等有机不同细胞对葡萄糖利用相似，在无氧条件下还产生乳酸等有机酸。酸。不能利用：多糖、双糖、寡糖等聚合物。不能利用：多糖、双糖、寡糖等聚合物。利用：单糖单体化合物。利用：单糖单体化合物。主要是葡萄糖主要是葡萄糖1、糖类、糖类 动物细胞培养细胞培养基制备 氮源作用：主要是构成含氮化合物氮源作用：主要是构成含氮化合物 不能利用：多肽、蛋白质等高分子聚合物。不能利用：多肽、蛋白质等高分子聚合物。利用：氨基

31、酸等单体化合物。利用：氨基酸等单体化合物。12种是必需氨基酸：种是必需氨基酸：Arg、Cys、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr、Val。必须在培养基中添加，才能满足细胞的生长必须在培养基中添加，才能满足细胞的生长2、氨基酸、氨基酸 动物细胞培养细胞培养基制备 作用：一类微量的小分子有机物，既不是细胞的物质基础，作用：一类微量的小分子有机物，既不是细胞的物质基础，也不是能量物质，但对代谢和生长起调节和控制作用。也不是能量物质，但对代谢和生长起调节和控制作用。水溶性维生素：水溶性维生素：B族维生素和维生素族维生素和维生素C 脂溶性维生素：维生素脂溶性维生素：维

32、生素A、D、E、K四种。四种。3、维生素、维生素 动物细胞培养细胞培养基制备 作用：细胞代谢所需酶的辅基，调节酶活性，细胞构成成分作用：细胞代谢所需酶的辅基，调节酶活性，细胞构成成分 参与生理活动。参与生理活动。维持水平衡、保持渗透压和酸碱平衡。维持水平衡、保持渗透压和酸碱平衡。胞外无机盐对维持正常生长环境很重要。胞外无机盐对维持正常生长环境很重要。4、无机盐类、无机盐类 动物细胞培养细胞培养基制备 激素：调节细胞的生长（刺激作用），胰岛素。激素：调节细胞的生长（刺激作用），胰岛素。贴附因子：细胞的贴壁生长必需，如胶原。贴附因子：细胞的贴壁生长必需，如胶原。脂类化合物：不饱和脂肪酸，如亚油酸、

33、固醇等。脂类化合物：不饱和脂肪酸，如亚油酸、固醇等。载体蛋白：铁离子。载体蛋白：铁离子。5、激素与附加成分、激素与附加成分 动物细胞培养细胞培养基制备 培养基种类培养基种类 天然培养基天然培养基 合成培养基合成培养基 无血清培养基无血清培养基动物细胞培养细胞培养基制备 概念：直接取自于动物组织提取液或体液作为培养基概念：直接取自于动物组织提取液或体液作为培养基 种类：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液种类：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液 特点：营养价值高，许多细胞系和原代及传代培养特点：营养价值高，许多细胞系和原代及传代培养 缺点：成分复杂，不稳定，来源受到限制，不宜大量生产使缺点：成分复

34、杂，不稳定，来源受到限制，不宜大量生产使用。具有血源性污染的可能性，病毒、支原体污染用。具有血源性污染的可能性，病毒、支原体污染 分离纯化：增加难度。分离纯化：增加难度。增加成本：工业化生产使用受限。增加成本：工业化生产使用受限。1、天然培养基、天然培养基 动物细胞培养细胞培养基制备 概念：用化学成分明确的试剂配制的培养基。概念：用化学成分明确的试剂配制的培养基。组成：糖、氨基酸、无机盐、维生素及其他成分。组成：糖、氨基酸、无机盐、维生素及其他成分。特点：组分稳定，容易配制。特点：组分稳定，容易配制。缺点：培养基中须添加缺点：培养基中须添加5-20血清血清，才能培养。，才能培养。已有几十种合成

35、培养基，大部分已商品化。如已有几十种合成培养基，大部分已商品化。如MEM、BME、DMEM、IMEM、HAM F12、PRMI1640、M199 2、合成培养基、合成培养基 动物细胞培养细胞培养基制备血清成分与作用血清成分与作用 含有基本的营养成分：补充合成培养基成分的不足含有基本的营养成分：补充合成培养基成分的不足 脂肪酸和微量元素：细胞生长所必需，磷脂质、胆固脂肪酸和微量元素：细胞生长所必需，磷脂质、胆固醇、前列腺素醇、前列腺素E，铜、锌、钴、钼、硒。，铜、锌、钴、钼、硒。激素和生长因子：细胞增殖、分化，胰岛素、胰岛素激素和生长因子：细胞增殖、分化，胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、

36、皮质醇、雌二醇。样生长因子、表皮生长因子、皮质醇、雌二醇。贴附和伸展因子：细胞贴壁所需，纤维结合蛋白、软贴附和伸展因子：细胞贴壁所需，纤维结合蛋白、软骨素、胶原等。骨素、胶原等。载体蛋白：白蛋白、转铁蛋白，金属、激素、维生素载体蛋白：白蛋白、转铁蛋白，金属、激素、维生素和脂类结合，带入细胞和脂类结合，带入细胞动物细胞培养细胞培养基制备血清成分与作用血清成分与作用 蛋白酶抑制剂：降解细胞死亡释放的蛋白质；消除毒蛋白酶抑制剂：降解细胞死亡释放的蛋白质；消除毒素和金属的毒性。素和金属的毒性。蛋白质：抗机械剪切，保护细胞免于损伤的作用蛋白质：抗机械剪切，保护细胞免于损伤的作用 缓冲物质：缓冲物质：K、

37、Na、Cl、Fe、Ca、葡萄糖等，稳定、葡萄糖等，稳定pH和渗透压和渗透压 来源：胎牛血清、新生牛或成牛血清、马血清、鸡血来源：胎牛血清、新生牛或成牛血清、马血清、鸡血清、羊血清及人血清。清、羊血清及人血清。应用于许多细胞系和原代及传代细胞培养。应用于许多细胞系和原代及传代细胞培养。动物细胞培养细胞培养基制备 概念：不添加血清、使细胞能在体外生长繁殖的的合成培养概念：不添加血清、使细胞能在体外生长繁殖的的合成培养基。基。组成：合成培养基基础之上，添加激素与生长因子、结合蛋组成：合成培养基基础之上，添加激素与生长因子、结合蛋白、贴壁与伸展因子、低分子量营养因子。白、贴壁与伸展因子、低分子量营养因

38、子。特点：提高了培养的质量，避免血清带来的麻烦，产品纯化特点：提高了培养的质量，避免血清带来的麻烦，产品纯化容易，组分稳定，大量配制。容易，组分稳定，大量配制。商品化的培养基：商品化的培养基：3、无血清培养基、无血清培养基 动物细胞培养细胞培养基制备 培养基质量控制培养基质量控制 培养用水质培养用水质 缓冲液缓冲液 生理盐水和平衡盐溶液生理盐水和平衡盐溶液 其他成分配制其他成分配制动物细胞培养细胞培养基制备 必需使用纯净水配制培养基必需使用纯净水配制培养基 水存放时间不宜超过水存放时间不宜超过2周周 普通水必需除去各类元素、有毒或有害物质及微生物普通水必需除去各类元素、有毒或有害物质及微生物和

39、热源，达到纯净水标准。和热源，达到纯净水标准。1、培养用水质培养用水质动物细胞培养细胞培养基制备 弱酸与弱酸盐：碳酸氢钠弱酸与弱酸盐：碳酸氢钠/碳酸体系碳酸体系 弱碱与弱碱盐：磷酸二氢钠弱碱与弱碱盐：磷酸二氢钠/磷酸氢二钠体系磷酸氢二钠体系 作用：作用：pH恒定。恒定。2、缓冲液、缓冲液 动物细胞培养细胞培养基制备 生理盐水：调节渗透压的盐溶液，生理盐水：调节渗透压的盐溶液，0.9%NaCl等渗能力等渗能力 平衡盐溶液：平衡盐溶液：BSS 由生理盐水，缓冲剂与指示剂、无机盐、葡萄糖等成分。由生理盐水，缓冲剂与指示剂、无机盐、葡萄糖等成分。作用：作用：满足细胞对盐离子营养的要求；满足细胞对盐离子

40、营养的要求；pH和渗透压的环境要求；直观和渗透压的环境要求；直观观察观察pH。加入酚红指示剂，酸性黄色、中性樱桃红、碱性紫红。加入酚红指示剂，酸性黄色、中性樱桃红、碱性紫红色。色。3、生理盐水和平衡盐溶液、生理盐水和平衡盐溶液动物细胞培养细胞培养基制备 用量：使用用量：使用L-型氨基酸，对于型氨基酸，对于DL-混合型氨基酸，使用量应该混合型氨基酸，使用量应该加倍。加倍。谷氨酰胺很不稳定：单独配制溶液。谷氨酰胺很不稳定：单独配制溶液。Gln浓度：浓度：100倍浓缩液，倍浓缩液，20保存保存 一般培养液中含量为一般培养液中含量为14 mmol/L。4、氨基酸的配制、氨基酸的配制 动物细胞培养细胞培

41、养基制备 不含葡萄糖的溶液常规高压灭菌。不含葡萄糖的溶液常规高压灭菌。含葡萄糖时，采用过滤除菌；或含葡萄糖时，采用过滤除菌；或115，15min 血清使用：需要灭活（血清使用：需要灭活（56，30min），过滤灭菌，按一定比），过滤灭菌，按一定比例加入。例加入。4保存。出现沉淀、混浊时，要重新配制。保存。出现沉淀、混浊时，要重新配制。5、培养基的灭菌、培养基的灭菌 动物细胞培养细胞培养基制备第十七章第十七章 动物细胞培养动物细胞培养 制药工艺制药工艺第一节第一节 制药动物细胞的表达与特征制药动物细胞的表达与特征第二节第二节 基因工程动物细胞系的构建基因工程动物细胞系的构建第三节第三节 动物细胞

42、培养基制备动物细胞培养基制备第四节第四节 动物细胞培养技术动物细胞培养技术第五节第五节 培养过程检测与工艺控制培养过程检测与工艺控制动物细胞培养第四节第四节 动物细胞培养技术动物细胞培养技术动物细胞培养技术动物细胞生长和基质依赖性动物细胞生长和基质依赖性 动物细胞培养基本过程动物细胞培养基本过程 动物细胞大规模培养方法动物细胞大规模培养方法 动物细胞培养操作方式动物细胞培养操作方式动物细胞培养动物细胞培养技术动物细胞生长和基质依赖性动物细胞生长和基质依赖性 生长基质生长基质 接触抑制接触抑制 贴壁依赖性细胞贴壁依赖性细胞 非贴壁依赖性细胞非贴壁依赖性细胞 兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞 概念：改变介

43、质表面特性，促进细胞贴附的物质。概念：改变介质表面特性，促进细胞贴附的物质。作用：为介质表面提供适量带电荷，细胞被吸附在介质上，作用：为介质表面提供适量带电荷，细胞被吸附在介质上，实现贴壁生长。实现贴壁生长。原理：细胞、玻璃和塑料介质表面带负电荷；要使细胞贴壁，原理：细胞、玻璃和塑料介质表面带负电荷；要使细胞贴壁，必须进行二价阳离子、糖蛋白或其它试剂交联，使之表面带正必须进行二价阳离子、糖蛋白或其它试剂交联，使之表面带正电荷。电荷。天然生长介质：胞外基质成分，胶原。天然生长介质：胞外基质成分，胶原。人工生长介质：多聚赖氨酸人工生长介质：多聚赖氨酸1、生长基质、生长基质 动物细胞培养动物细胞培养

44、技术 概念：细胞在生长基质上分裂增殖，逐渐汇集成片，当每个概念：细胞在生长基质上分裂增殖，逐渐汇集成片，当每个 细胞与其周围的细胞互相接触时，细胞就停止增殖。细胞与其周围的细胞互相接触时，细胞就停止增殖。特点：保持充足的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密特点：保持充足的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密 度不再增加。度不再增加。有：大多数细胞有：大多数细胞 无：少数悬浮培养细胞（癌细胞）无：少数悬浮培养细胞（癌细胞）2、接触抑制、接触抑制 培养基中的生长因子耗尽时也会产生生长抑制，所以将正常细培养基中的生长因子耗尽时也会产生生长抑制，所以将正常细胞因相互接触而抑制分裂的现象改称为密度依赖性

45、的生长抑制。胞因相互接触而抑制分裂的现象改称为密度依赖性的生长抑制。细胞膜上有糖类和蛋白质共同构成的糖蛋白，也叫做糖被，他细胞膜上有糖类和蛋白质共同构成的糖蛋白，也叫做糖被，他在细胞上起识别作用。当细胞增殖到一定程度，也就是互相挨在细胞上起识别作用。当细胞增殖到一定程度，也就是互相挨在一起的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续在一起的时候，糖蛋白识别了这种信息，就会使细胞停止继续繁殖，这种现象就叫做接触抑制。繁殖，这种现象就叫做接触抑制。动物细胞培养动物细胞培养技术 概念：生长需要在适量带电荷的固体或半固体支持表面，细概念：生长需要在适量带电荷的固体或半固体支持表面，细胞自身分泌或人

46、为在培养基中加入贴附因子，使细胞依附在支胞自身分泌或人为在培养基中加入贴附因子，使细胞依附在支持物表面，才能生长和增殖。持物表面，才能生长和增殖。大多数动物细胞都属于此类，细胞对培养用器皿的附着能力大多数动物细胞都属于此类，细胞对培养用器皿的附着能力的不同就是细胞贴壁性能代表了细胞的活力的不同就是细胞贴壁性能代表了细胞的活力。3、贴壁依赖性细胞、贴壁依赖性细胞 动物细胞培养动物细胞培养技术4、非贴壁依赖性细胞 动物细胞培养动物细胞培养技术4、非贴壁依赖性细胞、非贴壁依赖性细胞 概念：生长不依赖于固体支持物表面，可在培养液中悬浮生概念：生长不依赖于固体支持物表面，可在培养液中悬浮生长，有时被称为

47、悬浮细胞。长，有时被称为悬浮细胞。血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转化细胞属于此类，生长血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转化细胞属于此类，生长干扰素的干扰素的Namalwa细胞。细胞。概念：对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮概念：对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮生长。生长。如：如：CHO细胞、细胞、BHK细胞。细胞。理想的药物生产细胞系理想的药物生产细胞系5、兼性贴壁依赖性细胞、兼性贴壁依赖性细胞 动物细胞培养动物细胞培养技术 动物细胞培养基本过程动物细胞培养基本过程 原代细胞分离与培养原代细胞分离与培养 传代细胞培养传代细胞培养 细胞系的保存与复苏细胞系的保存与复苏动物

48、细胞培养动物细胞培养技术1、原代细胞分离与培养、原代细胞分离与培养动物组织或器官洗涤 粉碎酶解消化离心或过滤培养液稀释细胞洗涤接种培养 从体内取出组织或器官从体内取出组织或器官 经过粉碎、消化而获得单细胞经过粉碎、消化而获得单细胞 进行体外接种培养。进行体外接种培养。37消化消化，胰蛋白酶，胶原酶，胰蛋白酶，胶原酶 消化液浓度：消化液浓度：0.1-0.3 mg/ml动物细胞培养动物细胞培养技术动物细胞培养动物细胞培养技术动物细胞培养动物细胞培养技术动物细胞培养动物细胞培养技术动物细胞培养动物细胞培养技术动物细胞培养动物细胞培养技术动物细胞培养动物细胞培养技术2、传代培养、传代培养-过程过程 概

49、念：对长满表面的细胞进行消化分离，接种到新的概念：对长满表面的细胞进行消化分离，接种到新的培养基上，进行新一轮培养。培养基上，进行新一轮培养。传代时期：刚刚传代时期：刚刚全部汇合全部汇合的细胞。过早产量低，过的细胞。过早产量低，过晚健康状态不佳。晚健康状态不佳。消化方法：过程与原代细胞相同。用消化方法：过程与原代细胞相同。用3050倍体积的倍体积的0.25胰蛋白酶和胰蛋白酶和EDTA对细胞块消化，消化后再培养。对细胞块消化，消化后再培养。要注意消化程度，细胞对酶的反应不同，有的敏感，掌握好适宜的要注意消化程度，细胞对酶的反应不同，有的敏感，掌握好适宜的消化时间和方法，不要过度，获得细胞浓度均匀

50、，生长速度一致的消化时间和方法，不要过度，获得细胞浓度均匀，生长速度一致的传代细胞。传代细胞。防止细胞系之间、非细胞生物的污染。防止细胞系之间、非细胞生物的污染。动物细胞培养动物细胞培养技术3、细胞系的、细胞系的建立建立 动物细胞培养动物细胞培养技术一旦获得了稳定的有一定特性的细胞系，就一旦获得了稳定的有一定特性的细胞系，就建立细胞库，进行长期保存。根据药品生产建立细胞库，进行长期保存。根据药品生产的有关规定，必须建立的有关规定，必须建立原始细胞库原始细胞库和和生产用生产用细胞库或工作细胞库。细胞库或工作细胞库。WCB1QCWCB2QCQC原始培养物MCBQC内容：细胞活性检测、无内容：细胞活