竞争放射分析放射免疫分析课件.ppt

1、l放射免疫分析放射免疫分析 （Radio Immuno Assay,RIA）l竞争性蛋白结合分析竞争性蛋白结合分析 （Competitive Protein Binding Assay,CPBA）l放射受体分析放射受体分析 （Radio Receptor Assay,RRA）优点：优点：1、灵敏度高 3、应用范围广 2、特异性强 4、操作简单缺点：缺点：1、生物试剂，稳定性受多因素影响 2、灵敏度难以超过ag水平l*P+Q=（*PQ）+*P +P=（PQ）+P *P ：标记物：标记物 P ：未标记物：未标记物 Q ：特异性结合剂特异性结合剂l*Ag+Ag+Ab=（*AgAb）+（AgAb）+*

2、Ag+Ag 0 Max Min 条件：条件：1、*Ag定量、足量定量、足量 2、Ab限量限量 *AgAb 专用符号：专用符号：1、T 加入的加入的*Ag的放射性计数的放射性计数 2、B *AgAb免疫复合物的放射性计数免疫复合物的放射性计数 3、B0 Ag=0时时*AgAb放射性计数放射性计数 4、F 游离的游离的*Ag的放射性计数的放射性计数 T=B+F 5、NSB 非特异性结合产生的放射性计数非特异性结合产生的放射性计数 6、结合率：、结合率：B/T、B/B0、B/Fl标准品l标记物l特异性结合剂l化学结构化学结构：应与被测物具有相同的化学结构l化学纯度化学纯度：纯品l化学度量：化学度量：

3、准确l稳定性：稳定性：保持生物活性不变l要求要求：1、较高的比活度 2、生物活性与免疫活性：与标记前一致 3、放射化学纯度：95%4、稳定性l鉴定：鉴定：1、最大结合率 2、标准曲线比较法 3、稀释曲线比较法l要求：要求：1、亲和力 2、高滴度 3、特异性 4、可长期保存 三和常用特异性结合剂的比较三和常用特异性结合剂的比较 抗抗 体体 血浆特异结合蛋白血浆特异结合蛋白 受体蛋白受体蛋白 亲和常数亲和常数 1091011L/moL 108109L/moL 二者之间 特异性特异性 较高 交叉反应明显 高 制备制备 复杂、周期长 简单 高 稳定性稳定性 好 好 好 结果与生物活性关系结果与生物活性

4、关系 免疫活性 平行 平行 l抗原l动物选择l佐剂l免疫动物、收获鉴定抗体l亲和力亲和力：指抗体与抗原的结合能力，常用平衡亲和常数指抗体与抗原的结合能力，常用平衡亲和常数KA表示。表示。l特异性：特异性：抗体与相应抗原的结合能力与其它类似物结合能力的比较，常用抗体与相应抗原的结合能力与其它类似物结合能力的比较，常用 交叉反应率交叉反应率（Cross Reaction）表示）表示 交叉反应率交叉反应率=Y/Z100%Y：标准抗原取代：标准抗原取代50%结合率所对应的浓度结合率所对应的浓度 Z：类似物取代：类似物取代50%结合率所对应的浓度结合率所对应的浓度 交叉反应率测定：以比正常生理浓度高交叉

5、反应率测定：以比正常生理浓度高100倍以上的类似物为测定物进行测定，同倍以上的类似物为测定物进行测定，同时观察置换时观察置换0标准管标准管50时所对应的化学量时所对应的化学量l滴度：滴度：结合结合50%标记抗原时血清的稀释度标记抗原时血清的稀释度l特点：特点：特异性高 抗体成分专一 可反复制备l制备：制备：1、免疫小鼠，制备脾细 胞悬液 2、选择培养，用HAT培 养基筛选杂交瘤细胞 3、检测抗体 4、克隆化l血浆结合球蛋白血浆结合球蛋白l受体蛋白受体蛋白 方方 法法 特异性结合剂特异性结合剂 待测物待测物 放射免疫分析（RIA）T4抗血清 T4（免疫活性）竞争性蛋白结合分析（CPBA）TBG

6、T4（生物活性）放射受体分析（RRA）T4受体蛋白 T4受体结合位点 l分离方法的要求分离方法的要求 1、使结合部分与游离部分尽可能完全 分开 2、分得的成分便于作放射性操作 3、分离效果不受外界干扰因素影响 4、操作简便、分离迅速、重复性好 5、试剂来源广泛、价廉易得l双抗体法l聚乙二聚法（PEG）l活性炭吸附法l盐析法l微孔滤膜法lSPA法l固相抗体法：塑料、纤维素、凝胶颗粒、多孔玻璃微球l磁化颗粒法l屏蔽计数法l平衡法平衡法l顺序加样法顺序加样法lSTAT法法l高含量样品高含量样品：灵敏度高，B0/T在3050%l低含量样品：高剂量斜率好，B0/T在5070%lpH和离子强度和离子强度l

7、反应体积反应体积l添加剂添加剂l样品处理样品处理l实验设计、l配制试剂l加未标记物（标准品或待测样品）l加标记物l加特异性结合剂l混匀、温育l加分离剂、分离B与Fl测量各管放射性计数，绘制标准曲线l由标准曲线反求出样品浓度l单位点系统：单位点系统：Ag +*Ab (Ag-*Ab)+*Ab ImAd-Ag +*Ab ImAd-Ag-*Ab RIA IRMA 1、竞争性结合分析 非竞争性结合分析 2、三种主要试剂 二种主要试剂 3、*Ag-Ab 与 Ag 成反比 Ag-*Ab 与 Ag 成正比 4、标记抗原 标记抗体 5、反应达到平衡快 反应达到平衡快 6、NSB 主要影响高剂量反应 NSB 主要

8、影响低剂量反应 l单位点系统l双位点系统l标记第三抗体法l双标记抗体法l标记物的放射性活度高l反应达到平衡快l比RIA更高的灵敏度l比RIA的标准曲线范围更宽l比RIA的特异性更高l方法稳定性好l目前仅能检测大抗原l作图法作图法l数学模型计算法数学模型计算法l线性内插线性内插l多项式函数多项式函数l样条函数样条函数l直线化模型直线化模型lLogistic模型模型l四参数四参数lB1/B085%，Bn/B03lB0%：3070%，50%最佳最佳lNSB/T5%，NSB/B00.99l近期目的：近期目的：通过对测定结果的分析，对本次测定的质量作出评价，并按照预定的要求决定结果的取舍l远期目的：远期

9、目的：通过对不同批测定结果的比较，发现造成成误差的原因，从而改进实验条件或设计，以提高质量l试剂试剂l加样误差加样误差l分离误差分离误差l测量误差测量误差l数据处理数据处理l样品的采集与制备样品的采集与制备l用同一实验方法多次检用同一实验方法多次检测同一样品所得结果的测同一样品所得结果的一致程度和重复性一致程度和重复性l标准差、变异系数、效标准差、变异系数、效应误差关系、精密度图应误差关系、精密度图l测定值与真值的符合程度测定值与真值的符合程度l用回收试验及平行实验来评价用回收试验及平行实验来评价l测定方法的最小可测量测定方法的最小可测量l确定方法：确定方法：零标准管法、零标准管法、t值检验法

10、、值检验法、粗略估计法粗略估计法l特异性决定于抗体特异性决定于抗体l常用交叉反应率表示常用交叉反应率表示l指批间的重复性指批间的重复性l常用指标：常用指标：B0%、NSB、ED、r等等l与临床的符合程度与临床的符合程度l真阳性率、真阴性率、真阳性率、真阴性率、假阳性率、真阴性率假阳性率、真阴性率l批内质控：批内质控：l批间质控：批间质控：l目的：目的：提高各实验室之间检测结果的可比性l方法：方法：由一个单位提供方案及外部质量平价用的统一样品，分发到各参加单位进行检测，然后将所得结果反馈于负责单位进行整理分析、评价，用以促进检测质量的提高和资料的可比性。体外放射分析的误差体外放射分析的误差室内质

11、控室内质控室间质控室间质控批内质控批内质控批间质控批间质控批内精密批内精密度与偏听度与偏听偏信倚分偏信倚分析析批间精密批间精密度与偏听度与偏听偏信倚分偏信倚分析析寻找误差产生的原因、寻找误差产生的原因、改进分析工作质量改进分析工作质量对某种分对某种分析方法、析方法、试剂或试试剂或试剂盒进行剂盒进行综合评价综合评价对不同实对不同实验室的分验室的分析工作质析工作质量进行比量进行比较较向主管部门提供信息，对方法、向主管部门提供信息，对方法、试剂（盒）进行改进，促进实验试剂（盒）进行改进，促进实验室内部的质量控制工作室内部的质量控制工作l酶标记免疫分析法酶标记免疫分析法l化学发光法化学发光法l时间分辨免疫荧光分析法时间分辨免疫荧光分析法l基因芯片技术基因芯片技术