1、1,实验二 蛋白质定量分析,李立胜,2,待测溶液的浓度计算,1、利用标准管法计算待测溶液的浓度： 2、利用标准曲线进行换算： 3、利用吸光系数（消光系数）求出待测溶液的浓度。,3,利用标准曲线进行换算,1标准曲线的作用 (1)标准曲线又叫做校正曲线或工作曲线。从浓度一光密度直线的直线特性，判断所采用方法的呈色反应是否符合lambertBeer定律。 (2)作多次平行测定绘制标准曲线，可判断在整个测定过程中操作、仪器等误差的大小，确定该测定方法的可靠性。 (3)从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度。 (4)大批样品分析时，省略多次计算，从光密度值直接查阅标准曲线而求得被测物质的浓度。,标
2、准曲线的绘制,4,2标准曲线的作法,(1) 标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。 (2) 标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。 (3) 标准曲线图的绘制：一般常用光密度一浓度标准曲线。,5,标准曲线,根据Lambert-Beer定律， A与C成正比,配制一系列标准液 C1、C2、C3， 在max下，测相应的A1、A2、A3。,仪器型号 波长 日期 室温,测定物及测定方法名称,mg/ml,6,3、标
3、准曲线图的绘制,用座标纸作图。以横轴为浓度，纵轴为光密度。 绘制标准曲线时，将各座标点和原点连成一条线。 若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。 座标纸上注明：测定物及测定方法的名称，仪器型号、波长及绘制的日期、室温。 绘制标准曲线：一般应作二或三次以上的平行测定，重复性良好曲线方可应用。 绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。,7,双缩脲法 紫外分光光度法 BCA（二喹啉甲酸）法 Lowry法(Lowry改良法) 考马斯(Comessie)亮兰结合法 凯氏定氮法,蛋白定量分析的方法,8,双缩脲(NH2CON
4、HCONH2)或蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。,【原理】,蓝色,紫红色,优缺点,操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小； 灵敏度较差，特异性不高。-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。,9,10,【操作】,37度20min，540nm比色,11,【结果】,(一)在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。 (二)从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g/L)，并求出人血清样本的蛋白质浓度。 (三)从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白质浓度(g/L)。,12,原始数据记录,日期，室温,实验项目,名字 组员,13,实验报告,1、实验原理（清晰） 2、实验步骤（简略但清晰） 3、数据记录及实验结果计算（数据带入的过程，若为定性实验则为观察到的现象） 4、实验结论 5、实验讨论（讨论实验失败的原因，实验可改良的地方等） 将原始记录置于第一页，装订一同上交,日期、室温,实验项目,
