获能和顶体反应教案课件.pptx

1、会计学1获能和顶体反应获能和顶体反应2第1页/共50页3国家中长期科学和技术发展规划纲要国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-20202006-2020）六、基础研究六、基础研究 4.4.重大科学研究计划重大科学研究计划 （4 4）发育与生殖研究）发育与生殖研究第2页/共50页4第3页/共50页5一一.精子获能精子获能 哺乳动物精子在离开雄性生哺乳动物精子在离开雄性生殖道时，还不能立即与卵子受精。殖道时，还不能立即与卵子受精。它必须在雌性生殖道内经历一段它必须在雌性生殖道内经历一段成熟过程，才获得受精能力。成熟过程，才获得受精能力。这这一现象称为获能（一现象称为获能（19511951年张

2、民觉年张民觉和和AustinAustin）。）。第4页/共50页6 体外获能体外获能 体内获能的研究常受到某些条件体内获能的研究常受到某些条件的限制。从雌性生殖道内特别是输卵的限制。从雌性生殖道内特别是输卵管内回收到的精子数量太少，不易检测管内回收到的精子数量太少，不易检测获能精子化学成分的改变。因此获能精子化学成分的改变。因此,研究研究精子获能一般采用体外获能的方法。精子获能一般采用体外获能的方法。第5页/共50页7第6页/共50页8影响获能的一些因素影响获能的一些因素(温度、温度、pHpH、渗透压、渗透压)大多数动物精子体外获能的温度为大多数动物精子体外获能的温度为37373838。有的动

3、物。有的动物(猪和羊猪和羊)精子获能的精子获能的最佳温度为最佳温度为3939。第7页/共50页9 获能的最适获能的最适pHpH为为7.4 7.4 8.0 8.0。低。低于于6.76.7时获能时间大大延长；豚鼠精时获能时间大大延长；豚鼠精子子pHpH低于低于7.67.6时则获能时间需时则获能时间需24 h24 h。pHpH高于高于8.28.2时，可缩短精子获能时间，时，可缩短精子获能时间，但不利于精子生存。但不利于精子生存。第8页/共50页10 渗透压对精子获能也产生重渗透压对精子获能也产生重要影响。低于要影响。低于270 mOsm270 mOsmkg kg H2O 或高于或高于343 mOsm

4、343 mOsmkg kg H2O 则影响则影响精子获能进程。最适宜的渗透压精子获能进程。最适宜的渗透压为为295295310 mOsm310 mOsmkgkgH H2 2O O 第9页/共50页11获能的种间和种内差异获能的种间和种内差异 体外获能所需要的时间，种间存在体外获能所需要的时间，种间存在着较大差异。在一些种类动物获能最短着较大差异。在一些种类动物获能最短时间为时间为0.5-1h0.5-1h如小鼠；另一些种类生如小鼠；另一些种类生物则需要物则需要7 78h8h，如兔及人。，如兔及人。第10页/共50页12精子获能的异质性精子获能的异质性 从同一个体射出的所有精子并不是从同一个体射出

5、的所有精子并不是同时发生获能。一些精子获能较快，另同时发生获能。一些精子获能较快，另一些则较慢，即所谓获能上的一些则较慢，即所谓获能上的“异质性异质性”或非均一性。或非均一性。第11页/共50页13精子获能的可逆性精子获能的可逆性 张民觉张民觉(1958)(1958)最早发现精子获能是一个可最早发现精子获能是一个可逆过程，获能精子一旦与精浆和附睾液接触，逆过程，获能精子一旦与精浆和附睾液接触，又可去获能又可去获能(decapcitation)(decapcitation)。如果把去获能的。如果把去获能的精子转移到雌性生殖道中，并使之停留一段时精子转移到雌性生殖道中，并使之停留一段时间，精于又可

6、重新获能。表明精浆和附睾液中间，精于又可重新获能。表明精浆和附睾液中存在着一种去获能因子存在着一种去获能因子(decapcitation factor，DF)DF)。如用超速离心除去如用超速离心除去DFDF，精子也可重新获得受精，精子也可重新获得受精能力。表明能力。表明DFDF参与获能的调节。一般认为参与获能的调节。一般认为DFDF是是一种糖蛋白。一种糖蛋白。第12页/共50页14获能期间精子出现的各种变化获能期间精子出现的各种变化1.1.胆固醇是维持细胞正常结构和功能所胆固醇是维持细胞正常结构和功能所必需的成分。质膜脂质双层内有丰富的必需的成分。质膜脂质双层内有丰富的胆固醇。获能期间精子质膜

7、胆固醇外流。胆固醇。获能期间精子质膜胆固醇外流。精子质膜胆固醇的丧失可使膜蛋白的分精子质膜胆固醇的丧失可使膜蛋白的分布发生改变布发生改变;可使膜的通透性发生改变可使膜的通透性发生改变,进而促进获能。进而促进获能。第13页/共50页15 人输卵管液中含有的白蛋白人输卵管液中含有的白蛋白(HSA)(HSA)，能，能结合并移去胆固醇；输卵管液高浓度的高结合并移去胆固醇；输卵管液高浓度的高密度脂蛋白密度脂蛋白(HDL)(HDL)可直接诱导胆固醇外流，可直接诱导胆固醇外流，其作用比白蛋白更强其作用比白蛋白更强.在精子体外获能时，在精子体外获能时，获能液中的牛血清白蛋白获能液中的牛血清白蛋白(BSA)(B

8、SA)，在有，在有HCOHCO3 3-存在时可与胆固醇结合，以浓度依赖方式存在时可与胆固醇结合，以浓度依赖方式刺激胆固醇外流。刺激胆固醇外流。第14页/共50页16获能期间精子出现的各种变化获能期间精子出现的各种变化2.2.胞内离子的改变胞内离子的改变 精子获能期间一些胞外精子获能期间一些胞外CaCa2+2+进入胞进入胞内，胞内内，胞内CaCa2+2+逐步升高，并呈时间依逐步升高，并呈时间依赖关系赖关系.HCO.HCO3 3-浓度增加浓度增加.Ca.Ca2+2+和和HCOHCO3 3-均能刺激腺苷酸环化酶均能刺激腺苷酸环化酶(AC)(AC)合成合成cAMPcAMP，胞内，胞内cAMPcAMP升

9、高进而促进精子获升高进而促进精子获能能.第15页/共50页173.3.活性氧活性氧第16页/共50页184.4.磷酸化磷酸化第17页/共50页第18页/共50页第19页/共50页21检测精子获能的方法检测精子获能的方法 超激活运动超激活运动 顶体反应顶体反应 精子穿卵试验精子穿卵试验(SPA)(SPA)CTC CTC法法第20页/共50页22超激活运动超激活运动(hyperactivated motility,HAM)(hyperactivated motility,HAM)精子一旦获能精子一旦获能,其运动类型发生显著改变其运动类型发生显著改变,精子头精子头部侧摆幅度和频率明显增加部侧摆幅度和

10、频率明显增加,而尾部振幅加大而尾部振幅加大,频率加频率加快快,呈现一种特殊的超激活运动或鞭打样运动呈现一种特殊的超激活运动或鞭打样运动(whiplash motility)(whiplash motility)。HAMHAM系受精前精子为了适应系受精前精子为了适应受精需要而发生的一类特殊的运动类型。受精需要而发生的一类特殊的运动类型。Yanagimachi(1970)Yanagimachi(1970)首先在仓鼠精子获能时观察到这首先在仓鼠精子获能时观察到这种现象。种现象。HAM HAM对于精子穿越输卵管峡部对于精子穿越输卵管峡部,克服输卵管上皮细克服输卵管上皮细胞的阻力胞的阻力,最后穿过卵丘细

11、胞及其细胞外基质和透明最后穿过卵丘细胞及其细胞外基质和透明带起着重要的作用。带起着重要的作用。第21页/共50页23顶体反应顶体反应(acrosome reaction,AR)(acrosome reaction,AR)获能后的精子在生理性诱导物如透明获能后的精子在生理性诱导物如透明带、孕酮带、孕酮,或非生理性诱导物如钙离子载或非生理性诱导物如钙离子载体体A23187A23187的诱导下的诱导下,可发生顶体反应可发生顶体反应,即即精子质膜与顶体外膜融合释放顶体内容精子质膜与顶体外膜融合释放顶体内容物。物。第22页/共50页24第23页/共50页25第24页/共50页第25页/共50页考马氏亮蓝

12、染色法考马氏亮蓝染色法第26页/共50页28精子穿卵试验精子穿卵试验(sperm penetration(sperm penetration of zona-free hamster egg assay)of zona-free hamster egg assay)将除去了透明带的仓鼠卵子与获能处将除去了透明带的仓鼠卵子与获能处理后的精子混合培养理后的精子混合培养,观察穿入卵子的精观察穿入卵子的精子数目子数目.第27页/共50页29CTC(chlortetracycline)CTC(chlortetracycline)法法 CTC CTC是一种抗菌素即金霉索。它可根据精是一种抗菌素即金霉索。它

13、可根据精子不同的获能和子不同的获能和ARAR阶段或精子表面差异进行染阶段或精子表面差异进行染色。它可将精子分为色。它可将精子分为3 3种类型，即种类型，即F F、B B和和ARAR型。型。第28页/共50页30二二.顶体反应顶体反应 当获能的精子接近或进入卵丘细胞或与卵当获能的精子接近或进入卵丘细胞或与卵透明带结合时被激活，其头部发生顶体反应或透明带结合时被激活，其头部发生顶体反应或称胞吐作用称胞吐作用(exocytosis)(exocytosis)。顶体反应使精子顶。顶体反应使精子顶体内所含的顶体酶释放出来，支持精子穿过卵体内所含的顶体酶释放出来，支持精子穿过卵透明带，从而导致精卵融合即受精

14、。透明带，从而导致精卵融合即受精。第29页/共50页31ARAR时细胞内时细胞内Ca2+Ca2+浓度的增加浓度的增加CaCa2+2+在在ARAR过程中起着关键的作用过程中起着关键的作用,大多数诱导剂诱导精大多数诱导剂诱导精子发生子发生ARAR时时,Ca2+内流是早期的反应之一内流是早期的反应之一.第30页/共50页32第31页/共50页33检测顶体反应的方法检测顶体反应的方法电镜法电镜法相差显微镜法相差显微镜法CTCCTC法法Hoechst 33258Hoechst 33258法法考马氏亮蓝染色法考马氏亮蓝染色法第32页/共50页34电镜法电镜法第33页/共50页35相差显微镜法相差显微镜法

15、该法适用于观察顶体较大的动物该法适用于观察顶体较大的动物精子精子,如豚鼠如豚鼠,仓鼠仓鼠,麝麝.顶体较小的精子不能用该法观察顶体较小的精子不能用该法观察.如小鼠如小鼠,大鼠大鼠,兔兔.第34页/共50页36第35页/共50页37Hoechst 33258Hoechst 33258法法 Hoechst 33258 Hoechst 33258是一种可结合是一种可结合DNADNA的荧光的荧光染料染料 .精子先在含精子先在含Hoechst 33258Hoechst 33258的培养基中预的培养基中预培养。只有死精子的核才能吸取这种染料，培养。只有死精子的核才能吸取这种染料，而具有完整质膜的活精子则不能

16、吸收。然后而具有完整质膜的活精子则不能吸收。然后固定精子，再以亲顶体的凝集素染色或用抗固定精子，再以亲顶体的凝集素染色或用抗顶体内含物的抗体染色。顶体内含物的抗体染色。第36页/共50页38三三.精子与透明带的识别和结合精子与透明带的识别和结合 透明带是一层包被在卵外的糖蛋透明带是一层包被在卵外的糖蛋白白 .人、兔、大鼠和小鼠透明带都由人、兔、大鼠和小鼠透明带都由ZP1ZP1、ZP2ZP2和和ZP3ZP3三种成分组成。三种成分组成。第37页/共50页39 ZP2ZP2和和ZP3ZP3以异二聚体的形式存在，排列成细丝以异二聚体的形式存在，排列成细丝状，细丝间由状，细丝间由ZP1ZP1连接连接 第

17、38页/共50页40 精子与卵子精子与卵子ZPZP之间的初级识别是由之间的初级识别是由ZP3ZP3和精子质膜上的和精子质膜上的ZP3ZP3受体介导的；精受体介导的；精子与子与ZP3ZP3结合诱发顶体反应的发生；发结合诱发顶体反应的发生；发生了顶体反应的精子与生了顶体反应的精子与ZP2ZP2相互作用，相互作用，发生次级识别和结合。发生次级识别和结合。第39页/共50页41第40页/共50页42精子与卵子透明带的初级识别和结合精子与卵子透明带的初级识别和结合ZP3ZP3的作用的作用 有许多证据表明，有许多证据表明，ZP3ZP3是精子的初级受体。证据包括：是精子的初级受体。证据包括：纯化的纯化的mZ

18、P3mZP3仅能与顶体完整的精子头部质膜结合；仅能与顶体完整的精子头部质膜结合；精子能与共价附着精子能与共价附着mZP3mZP3的玻璃珠结合，也能与转入的玻璃珠结合，也能与转入mZP3mZP3基因后能够分泌基因后能够分泌mZP3mZP3的畸胎瘤细胞结合；的畸胎瘤细胞结合；纯化的纯化的mZP3mZP3能诱发精子顶体反应；能诱发精子顶体反应；抗抗ZP3ZP3多肽的抗体能阻止精卵结合；多肽的抗体能阻止精卵结合；第41页/共50页43精子与透明带的次级识别和结合精子与透明带的次级识别和结合ZP2ZP2的作用的作用 顶体反应发生后，精子质膜脱落，精子表面顶体反应发生后，精子质膜脱落，精子表面与与ZP3Z

19、P3结合的受体也随之丢失。此时，精子与结合的受体也随之丢失。此时，精子与ZPZP间发生次级识别。间发生次级识别。ZPZP中负责与精子发生次级识别中负责与精子发生次级识别的是的是ZP2ZP2。mZP2mZP2能与顶体反应后的精子结合。能与顶体反应后的精子结合。mZP2mZP2的抗体能抑制顶体反应后的精子与的抗体能抑制顶体反应后的精子与ZPZP的次级的次级结合，而对顶体反应前顶体完整的精子与结合，而对顶体反应前顶体完整的精子与ZPZP间初间初级识别和结合没有影响级识别和结合没有影响 第42页/共50页44ZP1ZP1的作用的作用 小鼠卵子的小鼠卵子的ZPlZPl主要发挥结构支撑功主要发挥结构支撑功

20、能，它把能，它把ZP2ZP2、ZP3ZP3细丝横向连接起来，构细丝横向连接起来，构成透明带三维构象。然而，在其他动物，成透明带三维构象。然而，在其他动物，例如猪和兔的研究表明，例如猪和兔的研究表明，ZPlZPl也可能是精也可能是精子的次级受体，在精卵结合中发挥作用。子的次级受体，在精卵结合中发挥作用。第43页/共50页45精子表面的透明带结合蛋白精子表面的透明带结合蛋白 卵子卵子ZPZP蛋白作为精子受体，与精子上相应的配体蛋白作为精子受体，与精子上相应的配体(即透明带结合蛋白即透明带结合蛋白)相互作用精子表面的卵子结合蛋相互作用精子表面的卵子结合蛋白分为初级透明带结合蛋白和次级透明带结合蛋白。

21、白分为初级透明带结合蛋白和次级透明带结合蛋白。初级透明带结合蛋白位于精子顶体区质膜上。它与初级透明带结合蛋白位于精子顶体区质膜上。它与ZP3ZP3相互作用，诱发顶体反应的发生。次级透明带结合相互作用，诱发顶体反应的发生。次级透明带结合蛋白位于顶体反应后的精子表面，即顶体内膜上，它与蛋白位于顶体反应后的精子表面，即顶体内膜上，它与ZP2ZP2相互作用，在精子穿过相互作用，在精子穿过ZPZP过程中，次级透明带结合过程中，次级透明带结合蛋白始终使精子与蛋白始终使精子与ZPZP结合。结合。不同动物中，已有多种不同的精子蛋白被认为参与不同动物中，已有多种不同的精子蛋白被认为参与精卵识别和结合。精卵识别和

22、结合。第44页/共50页46半乳糖苷转移酶半乳糖苷转移酶(GalTase)(GalTase)B-lB-l，4 4半乳糖苷转移酶是最早报道的初级半乳糖苷转移酶是最早报道的初级卵子结合蛋白，它存在精子表面。卵子结合蛋白，它存在精子表面。纯化的纯化的GalTaseGalTase及其抑制剂和它的抗体均可抑制精卵相互及其抑制剂和它的抗体均可抑制精卵相互作用。该酶可特异地作用于作用。该酶可特异地作用于ZP3ZP3。实验证据表明，实验证据表明，GalTaseGalTase可能是精子上的初级可能是精子上的初级卵子结合蛋白。然而，来自卵子结合蛋白。然而，来自GalTaseGalTase基因敲除小鼠基因敲除小鼠的

23、精子在体内仍具有受精能力。的精子在体内仍具有受精能力。第45页/共50页47透明带受体激酶透明带受体激酶 p95p95 另一个初级卵子结合蛋白候选者是一另一个初级卵子结合蛋白候选者是一种跨膜受体，具有酪氨酸激酶活性，称为种跨膜受体，具有酪氨酸激酶活性，称为透明带受体激酶透明带受体激酶(zona receptor kinase,(zona receptor kinase,ZRK)ZRK)，又称，又称p95p95。酪氨酸磷酸化是精子受。酪氨酸磷酸化是精子受精所必需的，抑制酪氨酸蛋白激酶活性即精所必需的，抑制酪氨酸蛋白激酶活性即可阻止顶体反应，从而阻断受精。小鼠和可阻止顶体反应，从而阻断受精。小鼠和

24、人的精子中都有一种人的精子中都有一种95 kDa95 kDa的酪氪酸磷酸的酪氪酸磷酸化的蛋白质化的蛋白质.第46页/共50页48sp56sp56 sp56 sp56是小鼠精子表面的一种分子量为是小鼠精子表面的一种分子量为56 56 kDakDa的外周膜蛋白。它仅存在于顶体完整的精的外周膜蛋白。它仅存在于顶体完整的精子表面子表面.sp56.sp56存在于成熟小鼠精子头部背区。存在于成熟小鼠精子头部背区。纯化的纯化的sp56sp56可与小鼠卵结合，并在体外抑制可与小鼠卵结合，并在体外抑制精卵结合。精卵结合。sp56sp56存在于小鼠和仓鼠精子表面。存在于小鼠和仓鼠精子表面。所以所以,小鼠和仓鼠的精子都能与小鼠卵透明带小鼠和仓鼠的精子都能与小鼠卵透明带结合。人和豚鼠精子不含结合。人和豚鼠精子不含sp56sp56，因此不能与，因此不能与小鼠卵透明带结台。小鼠卵透明带结台。sp56sp56是小鼠精子表面卵是小鼠精子表面卵子结合蛋白的又一个主要候选者。子结合蛋白的又一个主要候选者。第47页/共50页思考题思考题1.1.简述获能期间精子出现的变化。简述获能期间精子出现的变化。2.2.检测顶体反应的方法。检测顶体反应的方法。第48页/共50页50第49页/共50页51感谢您的观看。感谢您的观看。第50页/共50页