基于RNAi的害虫控制方法.ppt

1、基于RNAi的害虫控制方法内内容容提提要要 研究背景研究背景 RNAi靶基因的筛选靶基因的筛选 基于基于RNAi的害虫控制技术的害虫控制技术 小结与展望小结与展望2一、研究背景一、研究背景3研究背景研究背景lRNAi技术可望解决杀虫谱的专一性问题害虫控制的关键效 果安全性杀虫谱的宽窄物种水平群体水平杀虫谱：杀虫谱：广谱选择性专一性安全性好！安全性好！RNAi技术技术特异性沉默靶标基因靶标害虫的专一性控制4RNAi简介简介RNAi技术作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，正技术作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，正在功能基因组学领域掀起一场新的革命，并将彻底改变这个领域在功能基因组

2、学领域掀起一场新的革命，并将彻底改变这个领域的研究步伐。为此被的研究步伐。为此被Science评为评为2002年十大科学突破之首年十大科学突破之首(2001年为第年为第2，2003年为第年为第4)。RNAi是植物、动物（含昆虫）、线虫、真菌等真核生物的一种是植物、动物（含昆虫）、线虫、真菌等真核生物的一种强有力的基因表达抑制途径，主要通过强有力的基因表达抑制途径，主要通过dsRNA被核酸酶切割成被核酸酶切割成21-25nt的干扰性小的干扰性小RNA（small interference RNA,siRNA）,介导介导识别并靶向切割同源性靶识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现沉默靶基因的作用

3、。分子而实现沉默靶基因的作用。Andrew Z.Fire教授，教授，1959年生，因为年生，因为1998年年首先发现首先发现RNAi现象，于现象，于2006年获年获Nobel医学奖医学奖 56dsRNA的主要导入方法的主要导入方法注射法（注射法（injection）：）：注射dsRNA或siRNA 应用最广，用于基因功能研究等浸泡法（浸泡法（soaking）：）：浸泡虫体于dsRNA或siRNA溶液 仅在线虫Caenorhabditis elegans中成功饲喂法饲喂法（feeding）：）：喂食dsRNA溶液或表达dsRNA的细菌 线虫C.elegans中成功，中成功，1998,Timmon

4、s&Fire,Nature 果蝇中未成功，2000 planarians(2003，PNAS)2007年以来，棉铃虫、玉米根萤叶甲、甜菜夜蛾转基因植物法转基因植物法（transgenic plants):把目标基因的dsRNA转入植物中 棉铃虫、玉米根萤叶甲、甜菜夜蛾 7dsRNA的主要导入方法（续）的主要导入方法（续）dsRNA的导入方法注射法转基因植物介导法微生物介导法浸泡法饲喂法饲喂法是筛选靶标基因最便利的方法8只有饲喂法、转基因植物等方法只有饲喂法、转基因植物等方法才有可能应用于害虫控制才有可能应用于害虫控制9昆昆虫虫RNAi论论文文的的数数量量统统计计10昆虫的饲喂法昆虫的饲喂法RN

5、Ai 至2010年初，共报道13种昆虫的饲喂法RNAi可行。11昆虫的饲喂法昆虫的饲喂法RNAi（续）（续）PLoS ONE,2009;Insect Mol Biol,201012Double-deck of Parafilmartificial diet+dsRNAartificial diet+dsRNADouble-deck of Parafilmdaily replaced:artificial diet and dsRNA13基于基于RNAi的害虫控制的害虫控制安全性作用机制靶标基因靶标基因应用技术应用技术14二、二、RNAi靶基因的筛选靶基因的筛选效果好效果好安全性好安全性好15R

6、NAi靶基因的筛选标准靶基因的筛选标准 安全性好安全性好 什么叫做安全性好？指标？什么叫做安全性好？指标？效果好效果好 什么叫做效果好？什么叫做效果好？指标：死亡率高？繁殖力低？指标：死亡率高？繁殖力低？短期？长期？短期？长期？161、昆虫生长调节剂的靶标、昆虫生长调节剂的靶标 蜕皮激素、保幼激素蜕皮激素、保幼激素 几丁质代谢酶几丁质代谢酶 其它其它昆虫特有的蜕皮、变态等发育过程昆虫特有的蜕皮、变态等发育过程17（1）昆虫几丁质合成酶基因）昆虫几丁质合成酶基因A 非中肠基因：非中肠基因：甜菜夜蛾几丁质合成酶基因甜菜夜蛾几丁质合成酶基因A(SeCHSA)包括包括21个外显子和个外显子和20个内含

7、子，其中第个内含子，其中第17外显子是一个外显子是一个交替外显子。交替外显子。安全性：不存在于高等生物中。安全性：不存在于高等生物中。Insect Biochem Mol Biol,200718 几丁质合成通路几丁质通路中包括：几丁质通路中包括：海藻糖酶（海藻糖合成酶）海藻糖酶（海藻糖合成酶）,己糖激酶己糖激酶,葡萄糖葡萄糖-6-磷酸异磷酸异构酶构酶,果糖果糖-6-磷酸转氨酶磷酸转氨酶,葡葡糖胺糖胺-6磷酸磷酸-N-乙酰转氨酶乙酰转氨酶,磷乙酰氨基葡萄糖变位酶磷乙酰氨基葡萄糖变位酶,UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化乙酰葡糖胺焦磷酸化酶和酶和 几丁质合成酶。几丁质合成酶。(Kramer et al

8、.,1986)19发现昆虫非中肠基因可作为发现昆虫非中肠基因可作为RNAi的靶标基因的靶标基因Insect Biochem Mol Biol,2007;Bull Entomol Res,2008;PLoS ONE,2009几丁质合成酶基因Al 非中肠表达基因l 昆虫几丁质 合成通路的 关键基因成功沉默了该基因，并获得死亡表型。科学意义大大拓宽了靶标基因的来源提示昆虫体内存在干涉RNA的传导机制20良好的良好的RNAi效果：效果：mRNA 存活率存活率 畸形畸形 *21RNAi导致导致害虫害虫表皮和气管畸形表皮和气管畸形幼虫蜕皮一半22050100150200controlmiR-2703dsC

9、HSAegg number产卵量无显著差异abc020406080100controlmiR-2703 dsCHSAhatching rate(%)孵化率显著降低几丁质合成酶基因几丁质合成酶基因A被被干涉后的产卵量和孵化率干涉后的产卵量和孵化率（未发表数据）23卵数量差异不明显卵发育程度有差异dsCHSAcontrolmiR-2703dsCHSAcontrol几丁质合成酶基因几丁质合成酶基因A被干涉后的卵巢发育被干涉后的卵巢发育（未发表数据）24(2)海藻糖合成酶基因海藻糖合成酶基因 褐飞虱海藻糖合成酶基因在脂肪体，卵巢，中肠中都有表达。褐飞虱海藻糖合成酶基因在脂肪体，卵巢，中肠中都有表达。安

10、全性：不存在于脊椎动物中。安全性：不存在于脊椎动物中。RNAi后，酶活力和害虫（褐飞虱）存活率均显著降低。后，酶活力和害虫（褐飞虱）存活率均显著降低。存活率存活率组织分布组织分布 Insect Mol Biol,201025(3)蜕皮激素受体基因蜕皮激素受体基因 功能：调控昆虫发育、变态及繁殖等生命过程。安全性：安全性：昆虫特有。昆虫特有。RNAi后，甜菜夜蛾存活率下降至后，甜菜夜蛾存活率下降至5%左右。左右。PLoS ONE,2010（甜菜夜蛾）26n 蜕皮激素受体被RNAi后，棉铃虫的死亡率达60%PLoS ONE,20122728Offspring per pair decreased

11、after feeding on diet with dsNlEcR-c for 10 days.Int.J.Boil.Sci,2014292、其它靶标基因、其它靶标基因30snf7基因基因 死亡率高 Monsanto公司：snf7 是由226个氨基酸组成的蛋白。它是转运必需内体分选复合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）的一个组成部分，是一个至关重要的基因参与真核生物的生长发育过程。31对玉米根萤叶甲的控制效果对玉米根萤叶甲的控制效果PLoS ONE,201232三、三、基于基于RNAi的害虫控制技术的害虫控制技术

12、33前景：前景：Bt作物作物+基于基于RNAi的转基因作物的转基因作物1、转基因植物、转基因植物34转昆虫转昆虫基因基因dsRNA的玉米的玉米可显著可显著减轻害减轻害虫的危虫的危害害Monsanto公司Nat Biotech.,200735转棉铃虫蜕皮激素受体基因的烟草转棉铃虫蜕皮激素受体基因的烟草1周3周PLoS ONE,201236pCanG-NlEcR-c11250 bpKanNPTIIAntisense arm(371bp)(822)35S(1273)IntronHA-Tag(1198)Sense arm(362bp)(279)NOS-Ter35SpolyARBLBSac I(279)

13、Sal I(1193)pSK-hpRNAi3790 bpIntron左臂(366bp)右臂(370bp)BamHI(174)HindIII(3783)SacI(544)SalI(3417)pSK-NlEcR-c 3790bpintermediate vector expression vector Restriction Enzyme digestion LigationGenerated GM rice by ATMT(mediated by LBA4404)水稻品种：日本晴水稻品种：日本晴GM riceSense arm(362bp)Antisense arm(371bp)转褐飞虱蜕皮激素

14、受体基因的水稻转褐飞虱蜕皮激素受体基因的水稻Int.J.Boil.Sci,201437蜕皮激素受体基因（蜕皮激素受体基因（EcR）的控害效果）的控害效果饲喂转褐飞虱EcR基因水稻后，褐飞虱的死亡率仅为10%左右，但繁殖力却减少了22.78%-77.83%，而且出现致死表型。38转转snf7基因的转基因玉米的田间试验基因的转基因玉米的田间试验 三者合一：三者合一：Bt+抗除草剂抗除草剂+snf7 的的RNAi 特异性好特异性好 田间防治效果好田间防治效果好（Monsanto公司）392、微生物介导的、微生物介导的RNAi技术技术 昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒 Bt等细菌等细菌 绿僵菌等真菌绿僵菌等真

15、菌40四、小结与展望四、小结与展望4142小小 结结 RNAi技术在害虫控制中具有广阔的应用前景，可技术在害虫控制中具有广阔的应用前景，可实现物种专一性控制。实现物种专一性控制。需要加强需要加强RNAi靶标基因的筛选：安全性、控害效靶标基因的筛选：安全性、控害效果。果。转基因植物和微生物介导的转基因植物和微生物介导的RNAi技术有望在不久技术有望在不久的将来实现产业化。的将来实现产业化。43Acknowledgements Prof.Xu XP Dr.Chen,XF Dr.Tian HG Dr.Chen J Dr.Yu,R Dr.Yao Q Mr.Li TC National Natural Science Foundation of China National Basic Research Program of China