1、蛋白质双向电泳知识蛋白质双向电泳知识学习学习蛋白质组学（蛋白质组学（proteomics）l概念：是从整体角度分析生物体蛋白质组动态变化的一门科学l研究内容：蛋白质的识别、定量；蛋白质的定位、修饰；蛋白质之间的相互作用并根据这些研究最终确定它们的功能双向电泳(2DE/DIGE)实验组和对照组样品制备提出生物学问题凝胶图像分析差异蛋白点选取蛋白酶解及质谱分析差异蛋白点的成功鉴定生物学问题的解释技术流程技术流程 双向电泳双向电泳(2DE/DIGE)l目前进行蛋白质组学分析的最常规实验技术l能实现多达10000种不同蛋白质进行分离分析双向电泳（2DE）示意图提取的总蛋白溶液等电聚焦，实现蛋白质按等电
2、点进行分离SDS-PAGE分离，使得蛋白质按分子量大小排序分子量大小通过双向电泳使得不同等电点和分子量的蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同位置从而实现蛋白质的双向分离硝酸银染色图谱考马斯亮蓝染色图谱2DE图谱图谱双向电泳（DIGE）示意图样品1：Cy3标记样品2：Cy5标记将标记的样品混合双向电泳分离荧光扫描仪扫描图像重叠分析DIGE图谱图谱样品制备样品制备l双向电泳的最关键步骤之一l制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽可能简单的操作步骤，注意防止样品提取过程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、盐离子等干扰物质等电聚焦等电聚焦l通过10000V高压使得蛋白质按照其等电点特性进行聚焦l步骤：胶
3、条水化、低压除盐、高压聚焦、低压维持l聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹，过长会造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品类型、蛋白载样量、PH范围和胶条长度来确定。胶条平衡胶条平衡l等电聚焦结束后进行SDS-PAGE电泳之前需进行胶条平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS充分结合，保证SDS-PAGE电泳的顺利进行l步骤：一般采用两步平衡法，用含SDS、DTT、尿素和甘油等的缓冲液先平衡一次，再用碘乙酰胺取代DTT后再平衡一次SDS-PAGE电泳电泳l使得蛋白质按照分子量的大小不同而分离，与普通SDS-PAGE相似l在双向电泳系统中无需浓缩胶
4、，因为第一向等电聚焦已经使得蛋白得到浓缩蛋白检测蛋白检测理想显色剂的理想显色剂的7Sl安全（safety）l灵敏（sensitivity）l简单（simplicity）l特异性（specificity）l快速（speed）l稳定（stability）l兼容性（synergy）蛋白检测蛋白检测l硝酸银染色硝酸银染色 优点：灵敏度高，缺点：重复性差，质谱兼容性低l考马斯亮兰染色：考马斯亮兰染色：优点：重复性好，质谱兼容性高 缺点：灵敏度低l荧光染色：荧光染色：优点：重复性好，质谱兼容性高、灵敏度高 缺点：价格贵l其它染色方法：其它染色方法：胺基黑染色、印度墨水染色、金属盐负染等图像分析图像分析l常用软件：常用软件：Image-Master(Image-Master(GE Healthcare)PDquest(PDquest(Bio-Rad)l分析步骤：胶点检测和定量、凝胶匹配、比分析步骤：胶点检测和定量、凝胶匹配、比较分析较分析
