放射免疫技术课件.ppt

1、第七章第七章 放射免疫技术放射免疫技术第一节放射免疫技术第一节放射免疫技术 一、原理及分类一、原理及分类 二、常用的放射性核素二、常用的放射性核素 三、标记物制备及鉴定三、标记物制备及鉴定 四、抗血清鉴定四、抗血清鉴定第二节放射免疫分析第二节放射免疫分析 一、基本原理一、基本原理 二、实验方法及测定二、实验方法及测定第三节第三节 免疫放射分析免疫放射分析 一、基本原理一、基本原理 二、二、IRMAIRMA与与RIARIA的比较的比较思考题思考题小结小结免疫技术：免疫技术：以抗原以抗原-抗体反应原理为基础，抗体反应原理为基础，对样品中相应抗原或抗体进行检测。对样品中相应抗原或抗体进行检测。标记技

2、术：标记技术：将可被探测的示踪物质用化学方将可被探测的示踪物质用化学方法与化合物连接。法与化合物连接。标记免疫分析：标记免疫分析：用可微量或超微量检测的用可微量或超微量检测的示踪剂标记抗原、抗体，检测免疫反应结果并确示踪剂标记抗原、抗体，检测免疫反应结果并确定待检物。定待检物。标记免疫技术基本概念标记免疫技术基本概念常见标记免疫技术常见标记免疫技术放射免疫技术放射免疫技术酶免疫技术酶免疫技术荧光免疫技术荧光免疫技术 第一节第一节 放射免疫技术放射免疫技术早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析放射免疫分析(RIA)(RIA)，稍后又发

3、展了非竞争性结合的，稍后又发展了非竞争性结合的免疫放射分析免疫放射分析(IRMA)(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便异性强、重复性好、样品及试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药临床诊断领域中各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起物和肿瘤标志物的定量分析，对相关学科的发展起到了极大地推动作用。到了极大地推动作用。放射免疫放射免疫RIARIA以标记抗原与反以标记抗原与反应系统

4、中未标记应系统中未标记抗原竞争结合特抗原竞争结合特异性抗体来测定异性抗体来测定待检样品中抗原待检样品中抗原量。量。免疫放射免疫放射IRMAIRMA以过量标记抗体以过量标记抗体与抗原非竞争结与抗原非竞争结合，采用固相免合，采用固相免疫吸附载体分离疫吸附载体分离游离和结合标记游离和结合标记抗体。抗体。放射受体分析放射受体分析RRARRA放射配体结合放射配体结合分析分析RBARBA其它其它一、放射免疫技术原理及分类一、放射免疫技术原理及分类二、放射免疫技术常用的放射性核素二、放射免疫技术常用的放射性核素 125125I I 3 3H H 射线射线 理化性理化性 活泼活泼 差差核素丰度核素丰度 90%

5、90%半衰期半衰期 60.2d 12.3y60.2d 12.3y标记方法标记方法 简单简单 复杂复杂标记设备标记设备 低廉低廉 昂贵昂贵测量条件测量条件 简单简单 复杂复杂常用标记核素125125碘碘-标记物的制备标记标记物的制备标记125125I I-化学或酶促反应，将化学或酶促反应，将放射性负电碘离子氧放射性负电碘离子氧化成碘原子或正电碘化成碘原子或正电碘离子，通过取代反应离子，通过取代反应置换被标记物分子中置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原及组胺残基上的氢原子。子。125125I I或或125125I I+125125I I-标记物标记物（混合物）（

6、混合物）Ch-TCh-T、LPOLPO氧化氧化取代反应取代反应直接标记法直接标记法三、放射免疫技术标记物制备及鉴定使用无还原剂的高使用无还原剂的高比放射性碘源比放射性碘源被标记物用量要少被标记物用量要少chch-T-T用量要低用量要低控制总反应体积控制总反应体积200l200l反应时间反应时间1-21-2分钟分钟弱碱性反应条件弱碱性反应条件 间接标记法间接标记法联接标记联接标记(bolton-Hunter)预先将预先将125125I I用用ch-T法标记琥珀酰胺酯，制法标记琥珀酰胺酯，制成的成的125125I I 化脂功能基团可化脂功能基团可与蛋白分子上的氨基酸残与蛋白分子上的氨基酸残基反应，

7、从而使待标记物基反应，从而使待标记物被碘化。被碘化。bolton-Hunter125125碘碘-标记物的制备纯化标记物的制备纯化凝胶过滤法凝胶过滤法离子交换层离子交换层析法析法 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳 高效液相色高效液相色谱法谱法 聚合、聚合、损伤物损伤物 标记蛋白标记蛋白游离游离125125I I125125碘碘-标记物的制备鉴定标记物的制备鉴定 标记物质量标记物质量高比放射性高比放射性高纯度高纯度完整免疫活性完整免疫活性 放射化学纯度放射化学纯度单位标记物中结合于被标记单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百物上的放射性占总放射性的百分率分率应大于应大于95%95%

8、免疫活性免疫活性标记物与抗体结合的能力标记物与抗体结合的能力标记物与过量抗体反应百分比标记物与过量抗体反应百分比该值越大该值越大,标记物免疫活性好标记物免疫活性好 比放射比放射单位化学量标记物中单位化学量标记物中所含的放射性强度所含的放射性强度单位：单位：Ci/gCi/g mCi mCi/mg/mg Ci/mmol Ci/mmol 比放射性过高，将影比放射性过高，将影响标记物免疫活性响标记物免疫活性 计算法：计算法：依据标记反应中依据标记反应中放射性核素的利用率（标记放射性核素的利用率（标记率）来计算标记物的比放射率）来计算标记物的比放射性性.自身置换法自身置换法 ：比较标记抗：比较标记抗原与

9、标准抗原的免疫活性来原与标准抗原的免疫活性来测定标记物的比放射性测定标记物的比放射性 结果准，结果准，测定复杂测定复杂比放射性计算法比放射性计算法 结果结果欠欠准，准，计算计算简便简便 自身置换曲线自身置换曲线 反应系统：限量Ab和递增剂量(cpm)的标记抗原标记抗原的结合率(B/T%)随标记抗原总量的增加而减少 两条曲线平行,若标记抗原与标准品抗原具有相同的免疫活性标准曲线 反应系统:抗体（限量）、标记抗原（定量）和剂量递增的标准抗原组成 标记抗原与抗体的结合率(B/T%)随标准抗原的增加而竞争抑制性减少 比放射性自身置换法比放射性自身置换法 标准曲线与自身置换曲线平行标准曲线与自身置换曲线

10、平行表明在相同的放射性结合水平上，二实验中抗体上结合表明在相同的放射性结合水平上，二实验中抗体上结合 的抗原物质总量相同的抗原物质总量相同计算置换曲线平行段某结合率的放射性强度计算置换曲线平行段某结合率的放射性强度(cpm(cpm/ml/ml换算换算 为为nCinCi/ml)/ml)计算标准曲线平行段相应结合率对应的标准抗原化学量计算标准曲线平行段相应结合率对应的标准抗原化学量 (ng(ng/ml)/ml)以平行段多点结合率对应的放射强度和标准抗原量进行直以平行段多点结合率对应的放射强度和标准抗原量进行直 线回归，其斜率即为比放射性线回归，其斜率即为比放射性(nCi/ng(nCi/ng)四、放

11、射免疫技术抗血清鉴定四、放射免疫技术抗血清鉴定 抗体分子上一个抗原结合部抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定簇之间的位与相应的抗原决定簇之间的结合强度结合强度用亲和常数用亲和常数KaKa表示。表示。单位为稀度单位（单位为稀度单位（LMLM-1-1）KaKa值高（值高（10109 91212L/molL/mol）有助）有助于提高灵敏度、精确度和准确于提高灵敏度、精确度和准确度度 亲和性亲和性亲合力高亲合力高亲合力低亲合力低放射免疫技术抗血清鉴定放射免疫技术抗血清鉴定特异性特异性:指一种抗体识别相应抗原决定簇的能力指一种抗体识别相应抗原决定簇的能力交叉反应率：交叉反应率：将反应的最大结合率抑

12、制下降将反应的最大结合率抑制下降50%50%时特异性抗原与类似物的剂量（时特异性抗原与类似物的剂量（ED50ED50）之比）之比抗体交叉反应程度直接影响测定结果的准确性抗体交叉反应程度直接影响测定结果的准确性 特异性特异性效价效价五、方法学评价五、方法学评价除了常规的灵敏度、精密度、准确性、除了常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性之外，应注意以下指标：特异性和稳定性之外，应注意以下指标：可靠性可靠性剂量剂量-反应曲线反应曲线高剂量钩状效应高剂量钩状效应第第二二节节 放射免疫分析放射免疫分析一、放射免疫分析基本原理一、放射免疫分析基本原理竞争性结合反应的经竞争性结合反应的经典标记抗原（典

13、标记抗原（AgAg*）和）和非标记抗原（非标记抗原（AgAg）与限）与限量抗体量抗体(Ab(Ab)竞争性结合竞争性结合AgAg*和和AgAg具有等同的具有等同的与与AbAb结合能力结合能力AbAb限量，限量，AgAg*定量定量,AgAg*和和AgAg的量大于的量大于AbAb结合位点，二者结合位点，二者通过竞争方式与通过竞争方式与AbAb结合；随着结合；随着AgAg增加，增加，AgAg*与与AbAb结合形成结合形成AgAg*AbAb复合物的放复合物的放射量降低射量降低,二者变化二者变化成函数关系。成函数关系。以未结合的以未结合的AgAg*为为F F，AgAg*AbAb复合物复合物为为B B，则，

14、则B/FB/F或或B/(BB/(BF)F)与与AgAg的的量变存在着函数量变存在着函数关系剂量反应关系剂量反应曲线曲线 注：注：T即是即是B与与F的总和的总和二、放射免疫分析实验方法及测定二、放射免疫分析实验方法及测定抗原抗体反应抗原抗体反应AgAg*AgAg反应条件反应条件体积体积温度温度时间时间pHpHAbAb(标准标准Ag/Ag/样品样品Ag)Ag)平衡平衡非平衡非平衡一步法一步法二步法二步法分离结合、游离标记物分离结合、游离标记物二抗体沉淀法二抗体沉淀法 PEG PEG 沉淀法沉淀法 PR PR 试剂法试剂法 活性炭吸附法活性炭吸附法 分离彻底，迅速分离彻底，迅速分离试剂和过程不影分离

15、试剂和过程不影响反应平衡响反应平衡效果不受反应介质影效果不受反应介质影响响 操作应简单、重复性操作应简单、重复性好好经济经济 测量、数据处理测量、数据处理晶体闪烁计数器晶体闪烁计数器 包括了包括了NaINaI闪烁晶闪烁晶 体、光电倍增管体、光电倍增管 以及计数器以及计数器测量的放射性信测量的放射性信 号是仪器输出的号是仪器输出的 电脉冲数：每分电脉冲数：每分 钟计数钟计数(cpm(cpm)计算计算 参数参数cpmcpmB/T (%)B/T (%)F/T (%)F/T (%)B/F (%)B/F (%)B/BB/B0 0(%)(%)拟合拟合注：注：T T即是即是B B与与F F的总和的总和第第三

16、三节节 免疫放射分析免疫放射分析一、免疫放射分析基本原理一、免疫放射分析基本原理以过量以过量125125I I标记抗体与待测抗原进行非竞争标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应性免疫结合反应,用固相免疫吸附剂对用固相免疫吸附剂对B B或或F F进行分离，其灵敏度和可测范围均优于进行分离，其灵敏度和可测范围均优于RIARIA操作也较操作也较RIARIA简单。简单。单位点单位点 IRMAIRMA先用先用与与待测抗原进行反应，形成待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物；用抗原抗体复合物；用结合未结合标记抗体结合未结合标记抗体并将其分离并将其分离,测定测定的放射量的放射量 双位点双位点 IRMAIR

17、MA先用先用与抗原结与抗原结合，再用合，再用与抗原的另一决定与抗原的另一决定簇结合，形成簇结合，形成复合物，复合物，洗弃剩余标记抗体，测洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。固相上放射性。二、IRMA与RIA比较放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好精密度好,常用于各种激素、微量蛋白质、常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，试剂盒稳定期不长等诸多不足试剂盒稳定期不长等诸多不足,RIA,RIA将逐将逐渐被取代渐被取代。

18、放射免疫分析技术的应用放射免疫分析技术的应用1.1.放射免疫技术的核心是什么？放射免疫技术的核心是什么？2.2.制备放射性制备放射性125125I I标记物的基本原理是什么？有哪些方法？标记物的基本原理是什么？有哪些方法？3.3.评价评价125125I I标记物质量的指标有哪些？标记物质量的指标有哪些？4.4.用于放射免疫技术的抗体应满足哪些质量标准？用于放射免疫技术的抗体应满足哪些质量标准？5.5.放免分析中标记放免分析中标记/未标记抗原、抗体的用量特点及与免疫复合物未标记抗原、抗体的用量特点及与免疫复合物的量变关系？的量变关系？6.6.反应结束后，如何将免疫复合物与游离标记物分离开？反应结

19、束后，如何将免疫复合物与游离标记物分离开？7.7.放射免疫分析实验中，如何确定待测抗原的含量？放射免疫分析实验中，如何确定待测抗原的含量？8.8.免疫放射分析与放射免疫分析的反应原理有何不同？免疫放射分析与放射免疫分析的反应原理有何不同？9.9.闪烁计数器记录的信号即是放射核素的衰变吗？闪烁计数器记录的信号即是放射核素的衰变吗？10.10.灵敏度、特异性和测定范围，免疫放射分析与放射免疫分析有灵敏度、特异性和测定范围，免疫放射分析与放射免疫分析有何区别？何区别？思考题思考题放射免疫技术的基本原理是放射性核素可探测的灵敏性、放射免疫技术的基本原理是放射性核素可探测的灵敏性、精确性与抗原抗体反应的

20、特异性相结合，主要包括精确性与抗原抗体反应的特异性相结合，主要包括RIA和和IRMA。RIA所用的标记物应具备高比活度、高纯度所用的标记物应具备高比活度、高纯度和完整的免疫活性；抗血清应具有较高的抗体亲和力、和完整的免疫活性；抗血清应具有较高的抗体亲和力、高度的特异性和适宜的工作滴度；标准品浓度需按标准高度的特异性和适宜的工作滴度；标准品浓度需按标准进行标定；结合与游离反应物的分离（二抗法、进行标定；结合与游离反应物的分离（二抗法、PEG法、法、PR试剂法和固相法）应彻底、迅速、不影响反应平衡、试剂法和固相法）应彻底、迅速、不影响反应平衡、非特异性低和操作简便。拟合标准曲线需根据不同检测非特异性低和操作简便。拟合标准曲线需根据不同检测项目和不同的要求选用恰当的反应参数。项目和不同的要求选用恰当的反应参数。小小 结结