液体活检课件.pptx

1、1-2-32006年多国联合启动“国际癌症基因组计划”，已完成超过50种肿瘤异常谱型，是“人类基因组计划”后又一重大科学研究。2014年2月4日国际癌症基因组联盟(ICGC)公布超过1万个癌症基组的包括致癌突变、甲基化和基因copy数变化等数据。对癌症的认识：从“组织（细胞）鉴别”向“分子诊断”的历史转变！精准医疗：Precision Medicine Initiative在恰当的时候给患者以精准的治疗在恰当的时候给患者以精准的治疗Delivers the right treatment at the right time-液态活检通过非侵入性的取样方式获得肿瘤信息，辅助癌症治疗，是“精准医疗

2、”代表性的诊断技术。作为传统活检的替代技术，以及癌症早期筛查的新技术，液体活检正进入发展的黄金时期，4-Exosomes活细胞分泌活细胞分泌，40-100nm，1个活细胞状况实时监控指标母细胞来源标志物（RNA蛋白质），可用于早期诊断稳定，含量较高，内容物多样性，受干扰因素少检测相对简单ctDNA死细胞释放死细胞释放，杀伤性治疗效果的实时监控指标ctDNA是一组Panel，癌变标志物，没有组织特异性和无癌症分期的区分不稳定，含量较低，受干扰因素多CTC中晚期癌症指标，目前主要用于预后新的研究结果显示在早期癌症患者外周血中也能检测到CTC正在向活细胞捕获发展，用于后期分子分型，及药物选择稳定但含

3、量较少，分离鉴定难度大，依赖于新的技术进步复发监控用药指导超早预警早癌发现鉴别诊断疗效监控预后评估转移分析药物选择CTC、ctDNA 和外泌体的差异5-CTC、ctDNA 和外泌体在肿瘤各阶段的应用 血清蛋白标志物 血清/尿液外泌体蛋白标志物（中晚期诊断及疗效判断）血浆甲基化标志物 血清外泌体miRNA标志物 尿液外泌体RNA标志物（早癌诊断、鉴别及疗效判断）ctDNA Panel 外泌体/血小板RNA panel（早筛预警及现实风险评估）组织个体化用药标志物 ctDNA用药检测标志物CTC预后评估6-ctDNA的来源的来源7-标志组合（标志组合（panel）每种肿瘤都有数百基因，数千位点的不

4、同ctDNA，包含不同的突变。不断演变及变化不断演变及变化每个人、每个肿瘤、不同阶段、不同时间、不同治疗，其突变基因、位点、种类及含量都在动态变化。高度碎片化高度碎片化碎片大小范围分布在从30b-250bp，多数在140bp-160bp。含量少且变化大含量少且变化大cfDNA中多数野生背景，不同ctDNA片段的含量从0.01%到10%；超早期、高肿瘤特异性超早期、高肿瘤特异性，但缺少组织和器官特异性但缺少组织和器官特异性ctDNA的特征的特征8-ctDNA的临床应用的临床应用无创、全面、实时、便捷无创、全面、实时、便捷9-ctDNA指导用药指导用药CAPP-Seq NGS用于血浆ALK&ROS

5、1融合检测1.8例患者在血浆中均检测出ALK或ROS1融合2.接受克唑替尼治疗后，肿瘤缩小-AM.Newman,et al.Nat Med 201410-ctDNA预后评估预后评估1.ctDNA有PI3KCA检出的乳腺癌患者，其预后要比没有检出的患者差。-Breast Cancer Res Treat,2015,March2.ctDNA中PI3KCA拷贝数高的乳腺癌患者，其预后要比拷贝数低的患者差。11-ctDNA动态监测动态监测1.分别采集肿瘤样本和血液样本，对比了同一时间点采集的ctDNA和活体组织切片2.血液样本中的游离肿瘤DNA与活体肿瘤样本测序结果相匹配-J Clin Oncol.2

6、014 Feb 20;32(6):579-8612-13-中通量数十个点检测灵敏度高低通量数个点检测灵敏度最高高通量上万个点检测应用前景广阔荧光定量荧光定量PCR数字数字PCRNGS测序测序ctDNA检测平台检测平台14-假阳性问题：需要假阳性问题：需要纠错技术纠错技术1.NGS仪器本身问题：NGS是采用边合成边测序，合成过程掺入错误千分之几，甚至百分之几，需要鉴别“真突变”而不是引入的“假突变”。2.多重PCR扩增过程会引入一定比例的“假突变”。3.DNA上遗传SNP的干扰。漏检问题：需要漏检问题：需要补救技术补救技术1.技术本身问题。如ctDNA加接头，有效性仅10-15%，丢失80-90

7、%片段信息；2.超低频ctDNA在PCR扩增中淹没，也就是偏向扩增导致低频ctDNA片段遗失；3.断裂点附近的突变，在靶向富集后多重PCR中无法扩增；4.分析过程中无法分辨真实突变，真突变被舍弃。15-ctDNA靶向测序建库方法靶向测序建库方法Ion Ampli-seqIon Ampli-seqABI公司独有技术，通过多重PCR靶向扩增目的片段，能够以FFPE gDNA和血浆cfDNA为模板进行建库主要特点：能够特异性扩增目的片段，但受限于扩增体系引物间的互相干扰，靶位点数会受到限制，位点过多可能需要分多个引物pool，且扩增产物存在引物二聚体需要纯化去除。捕获建库捕获建库+单分子标签单分子标

8、签目前主流，技术相对成熟，90%研究者采用该方案，代表公司如Guardant Health、Foundation、Roche、吉因加、燃石等 主要特点：DNA探针或RNA探针杂交捕获，一次捕获多个目标区域，成本相对较高，无法随时增位点，无法检测断裂点附近的突变位点 单链成环单分子标签单链成环单分子标签 非主流，技术独创性强，代表公司如贝瑞和康、安可济等 主要特点：DNA分子单链成环，RCA扩增或多重PCR扩增建库，成本低，不需要合成探针芯片，随时可以增加位点，对靠近断裂点的突变位点有较好的检查率，单背靠背扩增受一次引物对数量制约（通量受限）16-ctDNA检测技术尚在不断发展中，还需要提升精准度，避免假阳性，减少漏检；临床大样本验证ctDNA技术和检测panel，包括从泛癌种到单肿瘤，尤其是肺癌等常见癌症的ctDNA检测panel的逐步临床转化；除个体化治疗上的机会，更大的机遇上应放在预防和康复领域。17-CTC的来源的来源18-19-20-21-22-