第二章-基因工程制药-新版3课件.ppt

1、目的基因：目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。1、物理分离法（1）分离方法（2）物理分离法实例（1）分离方法 直接用酶切割、或者机械破碎分离法。DNA经过直接用酶切割、或者机械破碎之后，可产生编码不同基因的DNA片段，由于不同基因中的G-C碱基对含量、与A-T碱基对含量有差异，结果就导致它们之间的密度不同，因此通过分离技术分离技术+观察技术观察技术+鉴定技术鉴定技术结合，就能将其分离。分离技术-平衡等密度离心法、凝胶电泳法、溴乙锭染色法。观察技术-荧光显微镜观察。鉴定技术-核酸杂交法、瑟萨恩印迹转移技术。概念概念-以以5或或3-脱氧核苷酸、脱氧核苷酸、5-磷酰基寡核苷酸片段为磷酰基寡

2、核苷酸片段为原料，用化学方法，将其逐个缩合成基因的方法，称为化学原料，用化学方法，将其逐个缩合成基因的方法，称为化学合成法。合成法。1976年年H.G.Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并提出了用化学方法合成基因的设想，并于于1979年在年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。基因的论文。要求：要求：1、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2、分子量较小的目的基因的制备分子量较小的目的基因的制备 DNADNA多聚酶多聚酶Klenow Klenow 片段片段+

3、dNTPs+dNTPs磷酸化磷酸化退火退火分子克隆分子克隆磷酸化磷酸化退火退火DNADNA多聚酶多聚酶Klenow Klenow 片段片段限制性内切酶限制性内切酶分子克隆分子克隆基因的化学基因的化学-酶促合成图解酶促合成图解较小分子蛋白质或多肽编码的基因，较小分子蛋白质或多肽编码的基因，15-30bp效果最好，效果最好，1天完成。现在可达到一次合成寡核苷天完成。现在可达到一次合成寡核苷酸片段长达酸片段长达50-60bp不能大于不能大于60bp;人工合成时，遗传密码的简并性可导致人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变中性突变 mRNA的分离mRNAmRNA-cDNA Hybridnick逆转

4、录酶逆转录酶RNase H DNA聚合酶聚合酶 T4连接酶连接酶T4 DNA聚合酶处理形成平头末端聚合酶处理形成平头末端NickTranslation cDNA的合成方法D2）、cDNA的片段与载体的连接1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。特点：mRNA反转录合成cDNA第一链后，不用不用再合成cDNA第二链只是在特异性引物作用下，扩增近g级级的特异cDNA产物通过RT-PCR成功克隆的基因：IL-2,3,6,9、G-CSF、TNF、IFN-等是一种在体外利用酶促反应大量获得特是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组异序列的基因组DNA或或cDNA的专门技术，又的专

5、门技术，又称为无细胞的分子克隆。称为无细胞的分子克隆。聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 PCR基本工作原理基本工作原理Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。岛屿获救岛屿获救PCRPCR法法nCpG岛富有G-C(60%)，有高含量的CpG二核苷酸。nCpG 岛含有罕见

6、的Eag I、Sac I、BssHI酶切位点，每个酶在CpG岛的酶切频率为1-2次/岛。nCpG岛是很多基因5端的标志。n对GenBank数据库375个基因的统计，几乎所有的看家基因与40%的组织特异性基因与CpG 岛相关联。nAlu重复较均一的散布在基因组，约每3kb出现1次。由由CpG 岛延伸至相邻的岛延伸至相邻的Alu重复的探针应能重复的探针应能用来分离与用来分离与CpG 岛相关联的基因。岛相关联的基因。选泡状接头及泡状引物是为了保证选泡状接头及泡状引物是为了保证PCR反应的选择反应的选择性。泡状引物的序列与泡状接头里非互补区的一条性。泡状引物的序列与泡状接头里非互补区的一条链的序列相同

7、。由于泡状引物不能与泡状接头里对链的序列相同。由于泡状引物不能与泡状接头里对应的链互补，只有应的链互补，只有Alu引物能够启动引物能够启动PCR反应进行第反应进行第一个扩增循环，其后两个引物均能参与扩增。这样，一个扩增循环，其后两个引物均能参与扩增。这样，不含不含Alu重复的重复的DNA 片段将不能被扩增。片段将不能被扩增。用罕见的限制酶切酵母人工染色体用罕见的限制酶切酵母人工染色体DNADNA，酶切片断连上，酶切片断连上泡状接头，用泡状引物和泡状接头，用泡状引物和AluAlu特异引物特异引物PCRPCR扩增。扩增。所扩所扩片断经琼脂糖凝胶电泳分离，找出特异片段来筛选片断经琼脂糖凝胶电泳分离，

8、找出特异片段来筛选cDNAcDNA文库文库。酶切片断连上泡状接头酶切片断连上泡状接头用泡状引物和用泡状引物和Alu特异引物特异引物PCR扩增扩增罕见的限制酶切罕见的限制酶切凝胶分离特异片段筛选凝胶分离特异片段筛选cDNA文库文库获得特异片段获得特异片段 此法会漏掉不含CpG岛的基因。如果Alu重复与CpG 岛相距太远而无法PCR扩增，相应的基因也会漏掉。此法对分离基因此法对分离基因5端十分有利，而基因端十分有利，而基因5端常是最难克隆的。端常是最难克隆的。粘粒粘粒DNA库经限制酶酶切库经限制酶酶切(也可不用酶切，用超声处理也可不用酶切，用超声处理并补平并补平)并连上接头，然后用并连上接头，然后

9、用5生物素标记的引物生物素标记的引物(与接头与接头1个臂的序列相同个臂的序列相同)做做PCR扩扩增。增。cDNA文库插入片断也用载文库插入片断也用载体引物行体引物行PCR，然后与生物，然后与生物素标记的基因组片段杂交。素标记的基因组片段杂交。基因组基因组DNA-cDNA复合物用复合物用链霉抗生物素蛋白覆盖的磁链霉抗生物素蛋白覆盖的磁珠捕捉。除掉未结合的非特珠捕捉。除掉未结合的非特异性异性cDNA。捕捉到的。捕捉到的cDNA洗脱后用载体引物行洗脱后用载体引物行PCR扩增。扩增。表达序列的磁珠捕捉法表达序列的磁珠捕捉法是具有代表是具有代表性，利用磁场力对性，利用磁场力对cDNA文库中目文库中目的基

10、因进行富集的一种方法。的基因进行富集的一种方法。编码序列富集法编码序列富集法 功能克隆法功能克隆法可采用基因敲除技术、RNAi技术、酵母双杂交技术及流式细胞术，从基因水平、表达调控水平、蛋白质水平和细胞水平获得基因功能信息基因功能信息。差异显示技术差异显示技术利用mRNA差异显示技术、减数PCR技术、差减杂交技术寻找新基因。如通过比较正常组织和肿瘤组织某些基因和蛋白质的差异表达，寻找在肿瘤细胞中的高表达基因表达基因或沉默基因沉默基因，从而推测可能是癌基因癌基因或抑抑癌基因癌基因。差异展示差异展示PCR法法（DD-PCR)原理：将具有两组细胞在某原理：将具有两组细胞在某一条件下可表达的一条件下可

11、表达的mRNA 群群体通过逆转录方法变成相应体通过逆转录方法变成相应的的cDNA 群体，以此为模板，群体，以此为模板，利用一对特殊引物，在一定利用一对特殊引物，在一定条件下进行条件下进行PCR扩增，得到扩增，得到与与mRNA相对应的相对应的DNA。通。通过变性聚丙烯酰胺电泳，检过变性聚丙烯酰胺电泳，检测差异条带。测差异条带。根据插入失活原理，筛选重组子。由于外源基因的插入，导致LacZ失去活性，菌落显白色，而未插入未插入重组子的菌落显蓝色蓝色。（二）、定向克隆法1、定义与方法2、连接方式3、优缺点 (1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接1

12、1、定义 在载体DNA、目的基因DNA的两端分别接上能够进行互相配对的同一碱基聚合单链，然后进行重组的方法，称为同聚接尾法同聚接尾法5 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA 3 5-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体Eco REco REco R人工接头及其应用

13、人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco R目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连 基因重组和基因工程（课堂练习）基因重组和基因工程（课堂练习）1.1.基因工程中常用的限制性内切酶是基因工程中常用的限制性内切酶是 A.A.型限制酶型限制酶 B.B.型限制酶型限制酶C.C.型限制酶型限制酶 D.D.核酸内切酶核酸内切酶E.E.核酸外切酶核酸外切酶2.2.催化催化DNADNA缺口平移反应的酶是缺口平移反应的酶是A.A.末端转移酶末端转移酶 B.DNAB.

14、DNA聚合酶聚合酶C.C.DNA DNA聚合酶聚合酶 D.DNA D.DNA聚合酶聚合酶E.E.Taq DNA Taq DNA聚合酶聚合酶 3.Klenow片断具有下列酶活性片断具有下列酶活性A.A.5 5 33 外切酶和外切酶和 5 5 33 聚合酶活性聚合酶活性B.B.5 5 33 和和3 3 55 外切酶活性外切酶活性C.5C.5 33 聚合酶聚合酶 和和3 3 55 外切酶活性外切酶活性D.D.5 5 33 和和3 3 55 聚合酶活性聚合酶活性E.5E.5 33 外切酶和外切酶和3 3 55 聚合酶活性聚合酶活性4.4.碱性磷酸酶的作用是碱性磷酸酶的作用是A.A.使核酸片段使核酸片段

15、3 3 端加上磷酸基端加上磷酸基B.B.去除核酸片段的去除核酸片段的3 3 端磷酸基端磷酸基C.C.去除核酸片段的去除核酸片段的5 5 端磷酸基端磷酸基D.D.使核酸片段的使核酸片段的5 5 端加上磷酸基端加上磷酸基E.E.使核酸链水解断裂使核酸链水解断裂5.下列是关于基因克隆常用载体的叙述，正确的是A.A.在连接酶作用下，载体可与目的在连接酶作用下，载体可与目的DNADNA连接构成重组体连接构成重组体B.B.载体是将目的载体是将目的DNADNA引入宿主细胞的运载蛋白引入宿主细胞的运载蛋白C.C.载体是将目的载体是将目的DNADNA引入宿主细胞的引入宿主细胞的DNADNA分子分子D.D.常用的

16、载体有质粒、噬菌体和病毒等常用的载体有质粒、噬菌体和病毒等 E.E.载体可将目的载体可将目的DNADNA运载入宿主细胞内而本身不进入细胞运载入宿主细胞内而本身不进入细胞6.6.DNADNA重组应包括下列过程重组应包括下列过程 A.A.分离并获得目的基因和载体分离并获得目的基因和载体B.B.连接目的基因和载体构成重组体连接目的基因和载体构成重组体C.C.将重组体导入宿主细胞内将重组体导入宿主细胞内D.D.从转化菌落中筛选并鉴定含阳性重组体的菌落从转化菌落中筛选并鉴定含阳性重组体的菌落E.E.以上都包括以上都包括精品课件精品课件！精品课件精品课件！7.7.目的目的DNADNA可来自可来自A.A.直接从组织中提取直接从组织中提取 B.B.基因文库基因文库 C.C.cDNAcDNA文库文库 D.PCRD.PCR扩增扩增 E.DNAE.DNA合成仪合成合成仪合成8.8.目的目的DNADNA与载体的连接方法可有与载体的连接方法可有A.A.粘性末端连接粘性末端连接 B.B.平头末端连接平头末端连接C.C.同源多聚尾连接同源多聚尾连接 D.D.人工接头法人工接头法E.E.载体分子的自身环化连接载体分子的自身环化连接