2.体外配体分析2017.ppt

1、体外放射配体结合分析 In vitro radioligand binding assay,北大三院核医学科 张卫方,科学的发展,技术方法的革新,科学和社会的进步,放免分析技术,大大加速了生命科学的研究进程,放免方法的创立：,放免方法创立之前：,物理或化学的方法检出毫克或微克水平.体内一些重要的微量物质无法测定.,分析方法发生了革命性的变化.可测定10-1210-15g水平.,微量测量技术的新纪元,核医学,Nuclear medicine,diagnosis,therapy,In vivo,In vitro,imaging,Non-imaging,微量物质的测定,体外放射性配体结合分析,Thy

2、roid imaging,measurement,激素的测定,Definition,在体外条件下 In vitro 以放射性核素标记的配体为示踪剂 Tracer 以结合反应为基础 Base 以放射性测量为定量手段 Means 对微量物质进行定量分析 Quantitative analysis 一类分析方法的总称。 General name,In vitro radioassay,核医学,放射免疫分析（RIA)- 最具代表性、应用最广泛的一种方法,特点： 高灵敏度（10-9-10 -15g) 高特异性 高精确度,Radioimmunoassay,核医学,我国的放免分析是1972年开始建立的。19

3、75-1985普及推广，至今为止，可进行300多种微量物质的测定。,1959年由Yallow和Berson 创立，并测定了糖尿病病人血浆中的胰岛素浓度。因此获得了1977年的诺贝尔医学奖.,History review,Berson & Yalow,1960年美国的Berson和Yalow 将核技术与免疫学技术相结合建立了放射免疫分析法，并首先用于测定血浆胰岛素浓度，由于该法对医学的巨大贡献，1977年Yalow获得了Nobel Prize。,Yalow,Berson,Radioimmunoassay,核医学,放免分析的发展,游离(free)激素浓度测定。 免疫反应发展到非免疫反应。 应用非放

4、射性即稳定示踪剂（如酶标、荧光、 化学发光）代替放射性示踪剂。,核医学,体外配体结合分析,体外放射配体结合分析,体外非放射配体结合分析,放免分析（RIA) 免放分析(IRMA) 竞争性蛋白结合分析 放射受体分析 放射酶学分析 放射微生物分析,时间分辨荧光分析 TRF 酶标免疫分析 EIA 化学发光免疫分析 CLIA 免疫聚合酶链反应,打起精神来，下面要进入重点啦,放射免疫分析,放射免疫分析的基本原理,放射免疫分析的基本条件,放射免疫分析的质量控制,Radioimmunoassay,RIA 放射免疫分析,是以抗原抗体的免疫反应为基础，利用待测抗原与定量的标记抗原同有限量的特异性抗体竞争性结合，以

5、放射性测量为微量定量手段，获得待测生物样品中抗原浓度的技术。,放射免疫分析,Primary principles,(B),(F),Ab,最小二乘法对各离散点进行直线回归而得出标准曲线是最好的方法。,放免分析的必备条件, B与F的分离技术,标记物：常用125I 方法： 125I-,氯胺T,125I2,一、 放射性核素标记的高纯度抗原(labeled Ag),对标记抗原 的要求：, 比活度（specific activity kBq/g) 免疫活性12个 I125原子为宜 稳定性 (stability) 放化纯度（Radiochemical purity),（ Radionuclide Lable

6、d Antigen ),二、标准品 （calibration standard),分为： 国家标准 药盒标准 质控标准,要求：与被测物为同一物质. 相等的化学结构和免疫活性. 高度纯化，不含杂质.,三、特异的抗体 (special antibody),亲和力(Affinity): 亲和常数K 特异性（Specificity)；交叉反应 （Cross Reaction) 滴度（Titer)；抗血清滴度曲线,与抗原比例最适当、检测抗原灵敏度最高、标准曲线斜率最大的稀释度。,四、B与F的分离技术 seperation technique,要求：,分离方法完全快速；不易受外界因素干扰；试剂易得，操作简

7、便，重复性好,双抗体法(double antibody method)-免疫方法 沉淀法(Precipitation method)-化学方法饱和硫酸铵液 吸附法、微孔滤膜法等 -物理方法 葡萄球菌A蛋白分离法（SPA法）生物方法 固相法(Solid phase seperation method),五、放射性测量仪器： 井型计数器,放射免疫分析的质量控制 （ Quality Control;QC),放射免疫分析中的误差及引起误差的原因 系统误差:由于某些特定的原因造成的带有倾向性的误差 试剂误差：标准品不准；标记物变质；抗体失效； 仪器误差：测量仪器不准；加样器不准 分离误差：分离不完全或失

8、误 数据处理误差：选用数学模型不当 随机误差：偶然因素造成的误差 同位素计数的统计涨落,放射免疫分析的质量控制指标(药盒质量评价),精密度：即重复性，是评价随机误差的指标，用标准差（SD）、变异系数（CV）、精密度图（PDP）表示 准确度：指测定值与真值的符合程度，偏离程度叫偏差，常以偏离真值的百分比表示，常用回收试验及平行性实验来评价 灵敏度：指测定方法的最小可测值， 即能与零剂量相区别的最小剂量，以零剂量点结合率的均数减两个标准差后的结合率的对应值作为最小可测值 特异性：常用交叉反应率来表示 临床有效性：诊断符合率，假阴性率、假阳性率,标准曲线的质控指标 （反映测定的稳定性和影响因素） 最

9、高结合率（B0%)：不加入 Ag, *Ag 与 Ab的结 合率 非特异结合率(NSB%):不加 Ab 时， *Ag 与非特异性物质的结合率，要求5-10% 标准曲线直线回归参数：截距、斜率和相关系数 ED25% 、ED50%、 ED75%。,日常检测工作中的内部质量控制,质控血清和质控图： Quality control profile 连续测定10批以上高、中、低三种已知浓度的质控血清（QCS),求出各自的x和标准差，画出质控图，以后每次进行RIA时同时测定高、中、低QRS，将其测得结果标在图上。,测定次数,Quality control profile,1s,1s,WHO结果判定标准：,三

10、种QCS中任意一个测定值3SD 三种QCS中在同一方向上有两种2SD 三种QRS在同一方向上1SD,结果应予舍弃,其它放射配体结合分析法,Immunoradiometric assay,IRMA 免疫放射分析,也是以抗原抗体的免疫反应为基础，不同的是放射性核素标记的是抗体，以过量标记抗体直接与待测抗原结合。因此，溶液中放射性与待测物的浓度呈正相关。为非竞争性结合分析。,AgAb*(过量)=Ag.Ab*Ab*,单位点法：,AgAb*(过量) Ag.Ab*Ab* (加吸附剂去除多余Ab*)。,双位点法(Ab2为McAb)-夹心法,具有代表性的固相免疫放射分析法： 固相Ab1(试管壁上)+Ag (固

11、相)Ab1.Ag (过量) + 过量Ab*2(McAb) 固相Ab1.Ag.Ab*2 +剩余Ab*(洗去),sandwich,Ab1,Ag,Ab2*,最后抗原被夹在两种抗体分子之间，测固相上的放射性(结合部分)。此法过量标记抗体易去除,NSB较低，灵敏度高；抗原结合部分需要有两个特定的抗原决定簇，故特异性较高。,Ab1,Ag,Ab2*,IRMA的特点,标记的过量抗体，非竞争性 反映速度快 灵敏度高 特异性强 稳定性好(抗体加样误差小),非放射性标记免疫分析技术,Enzyme immunoassay,EIA Chemical luminescence immunoassay, CLIA Time

12、-resolved fluoroimmunoassay,TrFIA,Enzyme immunoassay,EIA,标记物：酶；辣根过氧化物等 检测方法：加入酶的相应底物 检测体系：根据产物颜色的深浅 只需一般的光谱分析仪,化学发光免疫分析 （Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）,分为竞争法与夹心法两类,是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。,待测抗原,+,+,化学发光 标记抗原,抗体包被磁粒,化学发光免疫竞争法,+,丫啶酯,125I半衰期.天，而丫啶酯稳定期可达1年。,+,+,抗体包 被磁粒,待测 抗原,

13、形成抗原- 抗体复合物,化学发光标记抗体,形成抗体-抗原- 标记体原复合物,非竞争性结合分析法（夹心法）,+,是目前最灵敏的微量分析技术,其灵敏度高达10-19，较放射免疫分析（RIA）高出3个数量级。,时间分辨荧光分析 （Time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA）,时间分辨荧光分析检测原理,Ab-Eu + 增强液,Eu,荧光,激发,H2O,此种稀土元素被激发后产生的荧光寿命比一般荧光长， 可达12ms，因此可待短寿命的本底荧光衰退后再进行测量（即所谓延迟测量），减少干扰，提高灵敏度和准确度。能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法,Why?,发射光

14、谱峰范围窄 激发光和发射光之间大的Stokes位移 荧光强度高，寿命长,不同的非放射性分析法的灵敏度比较,非放射性免疫与体外放射分析的比较,试剂稳定，有效使用期长，可达12年 灵敏感度高，可达10-1419g 标准曲线稳定，可达24周，节省试剂 自动化程度高，减少加样误差 出结果迅速，适合急诊检测 缺点：仪器及试剂成本较放免高，试剂与仪器兼容差，不利于市场竞争。,体外分析的临床应用,内分泌系统 性腺及生殖系统 心血管系统 神经系统 血液系统 消化系统 泌尿系统 肿瘤疾病及其它,自学,RIA 及IRMA的基本原理是什么？二者有何区别 常用的非放射免疫分析方法有那些？,Answer them!,Reference books,核医学 （长学制教材） 临床核医学（潘中允） Textbook of nuclear medicine (James H.),