实验六从土壤中分离特定功能微生物课件.ppt

1、 爱护实验室公共用品，维持实验场所的清洁卫生；爱护实验室公共用品，维持实验场所的清洁卫生；用后的药品必须立即加盖收拾好，并清理天平上的用后的药品必须立即加盖收拾好，并清理天平上的杂物。杂物。灭菌锅锅盖上的通气软管不能弯折放置！灭菌锅锅盖上的通气软管不能弯折放置！微生物实验中用到的培养基固态为多，弃置时不得微生物实验中用到的培养基固态为多，弃置时不得倒入水池，必须倾倒入厕所的下水道。倒入水池，必须倾倒入厕所的下水道。水池内的防堵过滤网可以有效防止水池的通畅，不水池内的防堵过滤网可以有效防止水池的通畅，不得擅自移取丢弃。得擅自移取丢弃。显微镜使用后一定要注意做清洁工作，特别是油镜显微镜使用后一定要

2、注意做清洁工作，特别是油镜的清洁工作。亮度可调时要打小档后关闭。的清洁工作。亮度可调时要打小档后关闭。以上工作，由劳动委员总负责，班委成员和组长应以上工作，由劳动委员总负责，班委成员和组长应在所在小组里发挥带头模范作用，班级成员要自觉在所在小组里发挥带头模范作用，班级成员要自觉执行。执行。微生物所需要的营养物质 培养基及其种类 土壤中的微生物及其分布特点碳源碳源 （carbon sourcecarbon source）氮源（氮源（nitrogen sourcenitrogen source）生长因子生长因子（growth factorgrowth factor）水（水（waterwater）无

3、机盐（无机盐（mineral saltsmineral salts）3.1.2 微生物需要的营养物质微生物需要的营养物质u微生物细胞含水约占细胞鲜重的微生物细胞含水约占细胞鲜重的70709090，水作用是多方面的水作用是多方面的u水的功能水的功能：u是细胞中生化反应的良好介质是细胞中生化反应的良好介质u水的比热高，能有效的吸收代谢过程中放出的水的比热高，能有效的吸收代谢过程中放出的热量，不致使细胞的温度骤然上升热量，不致使细胞的温度骤然上升物质运输载体；物质运输载体；凡能供给微生物碳素的各种含碳化合物称为碳源。凡能供给微生物碳素的各种含碳化合物称为碳源。碳源功能：碳源功能：碳源种类：碳源种类：

4、v凡是可以构成微生物细胞和代谢产物中氮素凡是可以构成微生物细胞和代谢产物中氮素来源的营养物质都称为氮源。来源的营养物质都称为氮源。v氮源功能：氮源功能：为微生物提供合成其重要组分如蛋白质、为微生物提供合成其重要组分如蛋白质、核酸等的原料核酸等的原料 氮源氮源v分子态氮：固氮微生物以分子氮为分子态氮：固氮微生物以分子氮为 唯一氮源唯一氮源v无机态氮：铵盐、硝酸盐，无机态氮：铵盐、硝酸盐，几乎所有微生物能利用几乎所有微生物能利用 v有机态氮：牛肉膏、蛋白胨、酵母有机态氮：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏膏 等水解程度越高越容易利等水解程度越高越容易利用用v在利用微生物技术处理单一的缺乏在利用微生物技术处理单

5、一的缺乏氮素工业污水时，必须添加氮，如氮素工业污水时，必须添加氮，如尿素或人畜粪便。尿素或人畜粪便。氮源种类氮源种类v构成微生物细胞的组成成分构成微生物细胞的组成成分v有些无机盐如有些无机盐如S S、FeFe还可做为自养微生物还可做为自养微生物的能源的能源v构成酶活性基的组成成分，维持酶活性。构成酶活性基的组成成分，维持酶活性。MgMg、CaCa、K K是多种酶的激活剂是多种酶的激活剂.无机盐无机盐无机盐种类v阴离子盐：磷酸盐、硫酸盐、氯化物、碳酸盐、碳阴离子盐：磷酸盐、硫酸盐、氯化物、碳酸盐、碳酸氢盐。酸氢盐。v阳离子盐：氨、钾、钠、钙、镁、铁的盐阳离子盐：氨、钾、钠、钙、镁、铁的盐vP和S

6、、Fe、Mg的需求量较大v同时还需要锌、锰、钴、铝、铜、硼、钒、镍等微同时还需要锌、锰、钴、铝、铜、硼、钒、镍等微量元素。量元素。u生长因子：指微生物需要的，而又不能自己生长因子：指微生物需要的，而又不能自己合成的合成的微量有机物质微量有机物质，这些微量有机物对微，这些微量有机物对微生物生长有极重要作用。生物生长有极重要作用。包括：包括：u维生素：如维生素：如B1B1、B2B2、B6B6、B12B12、VCVCu氨基酸：如赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸等氨基酸：如赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸等u碱基如：嘌呤、嘧啶碱基如：嘌呤、嘧啶 请比较：微量元素和生长因子的区别？请比较：微量元素和生长因子的区别？生长因子

7、生长因子 培养基定义：培养基定义：根据各类微生物的营养需求，将水、根据各类微生物的营养需求，将水、碳源、氮源、无机盐及生长因子按照碳源、氮源、无机盐及生长因子按照一定比例配制，适合微生物的生长繁一定比例配制，适合微生物的生长繁殖及其他生理功能的组合基质。殖及其他生理功能的组合基质。1天然培养基天然培养基:主要成分是复杂的天然有机主要成分是复杂的天然有机物质，如马铃薯、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、物质，如马铃薯、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等。这些复杂天然有机物质的成分不完血清等。这些复杂天然有机物质的成分不完全了解，每次所用的原料，其中各成分的数全了解，每次所用的原料，其中各成分的数量也不恒定。这

8、类培养基是实验室常用的培量也不恒定。这类培养基是实验室常用的培养基，例如牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基，例如牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基等。养基等。2合成培养基合成培养基:用化学成分完全了解的纯试用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，如高氏剂配制而成的培养基，如高氏1号培养基，号培养基，查氏培养基等。一般用于营养代谢、分类鉴查氏培养基等。一般用于营养代谢、分类鉴定、菌种选育、遗传分析等。定、菌种选育、遗传分析等。3、半合成培养基、半合成培养基 1固体培养基固体培养基:在液体培养基中加入凝固剂即为在液体培养基中加入凝固剂即为固体培养基。实验用的凝固剂有琼脂、明胶和硅固体培养基。实验用

9、的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶，后者用于配制自养微生物的固体培养基。对胶，后者用于配制自养微生物的固体培养基。对其他多数微生物来讲，以琼脂最为合适，一般加其他多数微生物来讲，以琼脂最为合适，一般加入入1525%即可凝固成固体。此培养基可供即可凝固成固体。此培养基可供分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用。分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用。2半固体培养基半固体培养基:在液体培养基中加入少量凝固在液体培养基中加入少量凝固剂即为半固体培养基，例如琼脂只需加入剂即为半固体培养基，例如琼脂只需加入0207%。常用作细菌动力检查和菌种保存、噬菌。常用作细菌动力检查和菌种保存、噬菌体制剂的制备等。体制剂的制备等。

10、3液体培养基液体培养基:没有加琼脂，配好后成液体状态没有加琼脂，配好后成液体状态的培养基。常用于生理代谢的研究和工业发酵等。的培养基。常用于生理代谢的研究和工业发酵等。1基础培养基基础培养基：如牛肉膏蛋白胨培养基是如牛肉膏蛋白胨培养基是培养细菌的基础培养基；培养细菌的基础培养基；2营养培养基（加富培养基）营养培养基（加富培养基）：如培养人如培养人百日咳杆菌时必须添加血清的加富培养基；百日咳杆菌时必须添加血清的加富培养基；3选择培养基选择培养基：如纤维素分解菌培养基，如纤维素分解菌培养基，固氮培养基等；固氮培养基等；4、鉴别培养基：、鉴别培养基：如如EMB（伊红美兰培养基）（伊红美兰培养基）可以

11、迅速根据生长的外观判断大肠杆菌的可以迅速根据生长的外观判断大肠杆菌的存在。存在。一些典型的一些典型的培养基培养基 （1 1）细菌培养基：）细菌培养基：如牛肉膏蛋白胨培养基如牛肉膏蛋白胨培养基 （2 2）放线菌培养基：）放线菌培养基：如高氏一号培养基如高氏一号培养基 （3 3）真菌培养基：）真菌培养基：如马铃薯葡萄糖培养基如马铃薯葡萄糖培养基 （4 4）大肠杆菌鉴别培养基：大肠杆菌鉴别培养基：EMBEMB培养培养基基 成品成品培养基培养基（快餐型）（快餐型）微生物的培养条件微生物的培养条件v适宜的生长温度适宜的生长温度v适宜的适宜的PH值值v氧气需求氧气需求v光照与否光照与否根据微生物最适生长温

12、度的不同，可将根据微生物最适生长温度的不同，可将微生物划为微生物划为三个类型三个类型：温度影响v低温型微生物（嗜冷微生物）低温型微生物（嗜冷微生物）v中温型微生物（嗜温微生物）中温型微生物（嗜温微生物）v高温型微生物（嗜热微生物）高温型微生物（嗜热微生物）专性好氧菌专性好氧菌：必须在有较高的氧浓度条件：必须在有较高的氧浓度条件下才能生长。下才能生长。微好氧菌微好氧菌：只能较低的氧分压下才能正常生长：只能较低的氧分压下才能正常生长兼性好氧菌兼性好氧菌：在有氧或无氧条件下均能生：在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好。长，但有氧情况下生长得更好。氧气对微生物生长的影响氧气对微生物生长的

13、影响耐氧菌耐氧菌：可在分子氧存在下进行厌氧生活：可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。无毒害。厌氧菌：分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气中，固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施保证不同在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施保证不同微生物的生长。微生物的生长。培养好氧微生物：需震荡或通气，保证充足的氧气。培养好氧微生物：需震荡或通气，保证充足的氧气。好氧活性污泥工艺中，要保持溶解氧浓度好氧活性污泥工艺中，要保持溶解

14、氧浓度 2 mg/l 2 mg/l培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气。培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气。培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。供氧或隔氧一般措施供氧或隔氧一般措施习题习题v 是是微生物需要的，但又不能微生物需要的，但又不能自己分成的微量有机物质。自己分成的微量有机物质。v微生物需要的营养物质有微生物需要的营养物质有:_、_、_、和和 。v微生物的生长繁殖除了需要营养外，还需要微生物的生长繁殖除了需要营养外，还需要一些合适的培养条件：一些合适的培养条件：、和和 。v实验室常用的碳源有实验室常用的碳源有 和和_ _等，等，常用

15、常用的有机氮源有的有机氮源有_ _和和_ 等，等，无机氮源无机氮源有有_ _和和 等。等。习题习题v下面哪项不属于生长因子（下面哪项不属于生长因子（）A维生素维生素 B。氨基酸。氨基酸 C。硫酸盐。硫酸盐 D。核苷酸。核苷酸v下列属于微量元素的是（下列属于微量元素的是（）A：C、H、O B：Ca.、Mg C.：Zn.Cu D：P.、Sv常用来进行菌种分离鉴定的培养基是（）常用来进行菌种分离鉴定的培养基是（）固体培养基固体培养基 液体培养基液体培养基 半固体培养基半固体培养基 v微生物需要的营养物质有很多，但以下哪一微生物需要的营养物质有很多，但以下哪一种是不需要的？（）种是不需要的？（）A、水

16、、水B、无机盐、无机盐 C、琼脂、琼脂 D、生长因子、生长因子v 下面哪种培养基适合放线菌生长：（）下面哪种培养基适合放线菌生长：（）A、生肉膏蛋白胨、生肉膏蛋白胨B、麦芽汁琼脂、麦芽汁琼脂C、高氏一号培养基、高氏一号培养基 D、伊红美培养基、伊红美培养基实验六实验六 土壤中特定功能微生物土壤中特定功能微生物的富集和分离纯化方法的富集和分离纯化方法n理论讲解：n土壤中微生物分布特点；n土壤中微生物的富集和纯化方法；n特定功能微生物的种类和富集方法；土壤中微生物富集纯化的意义土壤中微生物富集纯化的意义 土壤是微生物生活最适宜的环境、它具有微生物土壤是微生物生活最适宜的环境、它具有微生物所需要为一

17、切营养物质和微生物进行生长繁殖及所需要为一切营养物质和微生物进行生长繁殖及生存的各种条件所以土壤中微生物的数量和种生存的各种条件所以土壤中微生物的数量和种类都很多。它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元类都很多。它们参与土壤的氮、碳、硫、磷等元素的循环作用。此外，土壤中微生物的活动对土素的循环作用。此外，土壤中微生物的活动对土壤形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作壤形成、土壤肥力和作物生产都有非常重要的作用。因此，查明土壤中微生物的数量和组成情况，用。因此，查明土壤中微生物的数量和组成情况，从土壤中分离出特定功能的微生物，从土壤中分离出特定功能的微生物，对发掘土壤对发掘土壤微生物资源和对土壤微生

18、物实行定向控制无疑是微生物资源和对土壤微生物实行定向控制无疑是十分必要的。十分必要的。实验实验六六 土壤中特定功能微生物土壤中特定功能微生物的的富集和纯化富集和纯化一、实验目的：一、实验目的：1.进一步熟练和掌握进一步熟练和掌握培养基的配制和分装、灭培养基的配制和分装、灭菌等技术。菌等技术。2、了解固氮菌和纤维素分解菌的培养基组成、了解固氮菌和纤维素分解菌的培养基组成特点；特点；了解了解从土壤中从土壤中分离纯化分离纯化特定功能微生特定功能微生物物的的方法和操作过程。方法和操作过程。葡萄糖葡萄糖 15.0g K2HPO4 0.5g MgS04 0.2g CaSO4 0.1g NaCl 0.2g

19、CaCO3 5.0g pH 7-8如需要做固体培养基，所加琼脂含氮量低为好。如需要做固体培养基，所加琼脂含氮量低为好。甘露糖醇甘露糖醇 15.0g K2HPO4 0.5g MgS04 0.2g CaSO4 0.1g NaCl 0.2g CaCO3 5.0g pH 7-8 1、用已灭菌后冷却至50oC左右的阿斯毕培养基倒成平板。2、用已灭菌的镊子将黄豆粒大的菜园土摆入已冷凝的平板培养基上。3、正面放置培养箱中培养，28oC培养34天后，在土粒周围有混浊半透明的胶状菌落出现，有的在后期会产生褐色的色素。第一排、第三排做固体平板上的固氮菌富集。第一排、第三排做固体平板上的固氮菌富集。将配制好的无氮液

20、体培养基，分装于100ml的三角瓶中，每瓶装 30ml，灭菌冷却后，各接种少许土壤，于 28-30度下培养 约7天，在液面可见到灰白色菌膜，慢慢会变为黑褐色。取液面菌膜制片，镜检。并对菌液做进一步的分离纯化。第二排、第四排做液体培养基中的固氮菌第二排、第四排做液体培养基中的固氮菌富集。富集。1L水中含：KH2PO4 1.00；MgSO4 0.3；NaCl 0.1；NaNO3 2.5；CaCl26H2O 0.1；FeCl3 0.01；pH 自然 第五排：固体培养基第五排：固体培养基第六排：液体培养基第六排：液体培养基 纤维素好氧分解实验步骤 n1制作平板：取已融化的纤维素好氧培养基，制作平板：取

21、已融化的纤维素好氧培养基，倒入无菌培养皿中，制成平板倒入无菌培养皿中，制成平板n2放置滤纸；用镊子取无菌滤纸放置滤纸；用镊子取无菌滤纸1张，放入已张，放入已凝固的琼脂平板上，紧贴，使滤纸表面湿润。凝固的琼脂平板上，紧贴，使滤纸表面湿润。n3加放土粒：用镊子取肥沃菜园土加放土粒：用镊子取肥沃菜园土10余粒余粒（或森林土粒）（或森林土粒），均匀排在滤纸表面，进行接，均匀排在滤纸表面，进行接种种(图图5-1)。图五图五 纤维素好氧分解实验纤维素好氧分解实验 4恒温培养：放入培养箱，恒温培养：放入培养箱，2830 C条件下培养条件下培养710d。5结果检查：先观察土粒周围有无黄色、桔黄色、结果检查：先

22、观察土粒周围有无黄色、桔黄色、棕色等色斑出现。土粒周围滤纸有无棕色等色斑出现。土粒周围滤纸有无破损破损变薄现象。变薄现象。用解剖针从带有色斑处挑取少许滤纸至载玻片上，涂用解剖针从带有色斑处挑取少许滤纸至载玻片上，涂片，固定，染色，在油镜下观察并绘图。片，固定，染色，在油镜下观察并绘图。将配制好的纤维素液体培养基，分装于100ml的三角瓶中，每瓶装 30ml，灭菌冷却后，用无菌镊子夹取滤纸条放入培养液，再接种少许土壤，于 28-30度下培养 约7天，观察培养液中滤纸条有无被分解而透空的地方，如果滤纸有空洞或滤纸边缘有破碎现象，表示厌氧纤维分解细菌已大量繁殖，否则应继续培养。4。镜检：用接种环从发

23、酵液滤纸破碎处取菌液一环至载玻片上，涂片，固定，染色，在油镜下观察并绘图。第六排做液体培养基中的纤维素分解菌富集。第六排做液体培养基中的纤维素分解菌富集。B 纤维素 厌氧分解实验n 3目检：取出试管，观察培养液中滤纸条有目检：取出试管，观察培养液中滤纸条有无被分解而透空的地方，如果滤纸有空洞或滤纸无被分解而透空的地方，如果滤纸有空洞或滤纸边缘有破碎现象，表示厌氧纤维分解细菌已大量边缘有破碎现象，表示厌氧纤维分解细菌已大量繁殖，否则应继续培养。繁殖，否则应继续培养。n 4。镜检：用接种环从发酵液滤纸破碎处取菌。镜检：用接种环从发酵液滤纸破碎处取菌液一环至载玻片上，液一环至载玻片上，涂片涂片，固定

24、，染色，在，固定，染色，在油镜油镜n下观察并绘图。下观察并绘图。1L水中含：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)20；Na2HPO4 2.5；KH2PO4 1.5；蛋白胨2.5；pH 7.07.5第七排做固体培养基；第八排做液体培养基。第七排做固体培养基；第八排做液体培养基。注意：在无菌培养基内直接接如土粒即可，不需要加滤纸注意：在无菌培养基内直接接如土粒即可，不需要加滤纸，因为已经含，因为已经含 羧甲基纤维素钠羧甲基纤维素钠 第2、4、6、8排做液体培养基，每人限量1 个；做固体平板富集菌种的，每人 2个平板；慎重选取采土地点，确保土样中相应的微生物含量较高，易于分离。要采集多种类型的土样，并在标签和报告中注明土样来源。全班同学务必采取多种土样来源，确保实全班同学务必采取多种土样来源，确保实验结果显著！验结果显著！必须确保所取土样的质量：一是要采土来必须确保所取土样的质量：一是要采土来源多样性，如森林土，草地土，沼泽土，源多样性，如森林土，草地土，沼泽土，菜园土等；另外取表土层菜园土等；另外取表土层 5-10cm以下的。以下的。数量满足接种就可以了。周二下午或者周数量满足接种就可以了。周二下午或者周三早上上课前取土为好。三早上上课前取土为好。