微生物发酵制药宝典-第十章2制药微生物菌种建立课件.ppt

1、制药工艺学制药工艺学主讲教师：元英进 教授天津大学化工学院制药工程系Pharmaceutical Technology第二篇第二篇 生物技术制药工艺生物技术制药工艺第十章第十章 微生物发酵制药工艺微生物发酵制药工艺10.1 10.1 概述概述10.2 10.2 微生物生长与生产的关系微生物生长与生产的关系10.3 10.3 制药微生物菌种建立制药微生物菌种建立10.4 10.4 制药微生物培养基制备制药微生物培养基制备10.5 10.5 灭菌工艺灭菌工艺10.6 10.6 微生物发酵培养技术微生物发酵培养技术10.7 10.7 发酵工艺过程的检测与控制发酵工艺过程的检测与控制10.3 10.3

2、 制药微菌种的建立制药微菌种的建立 10.3.1 新药生产菌种的选育新药生产菌种的选育 10.3.2 菌种保藏菌种保藏 10.3.3 菌种库建立与质量控制菌种库建立与质量控制 发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立制药生产对菌种的要求制药生产对菌种的要求 1.遗传稳定性：能长期繁殖，不易变异和退化。纯种，无杂菌及噬菌体。2.易生长性：生长旺盛、迅速；4.容易培养性：条件易控，利用价廉易得的原料。3.抗污染性：自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。4.经济性：发酵周期短，产量高，良好经济能力。5.突变敏感性：对各种诱变较敏感，提高的潜力大。菌种选育的目的：改善菌种的特性，使提高产量，改进质量，

3、降低成本，改革工艺，方便管理及综合利用10.3.1.1 自然分离自然分离 目的：出发菌的获取目的：出发菌的获取 样品的采集：大陆表层土壤，海洋水体样品的采集：大陆表层土壤，海洋水体 预处理：根据分离目的和微生物的特性。预处理：根据分离目的和微生物的特性。温度；化学处理；离心、膜过滤温度；化学处理；离心、膜过滤 培养基：选择性，营养和培养基：选择性，营养和pH；添加抑制剂。；添加抑制剂。分离方法：分离方法：（1）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲液）稀释法：无菌水，生理盐水，缓冲液（2）滤膜法：细菌在膜上，放线菌进入培养基。）滤膜法：细菌在膜上，放线菌进入培养基。培养条件：温度。放线菌：培养条件：温

4、度。放线菌：2530，3237，4550；714天至天至1月。月。发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立药物的筛选药物的筛选 琼脂扩散法琼脂扩散法活性测定：活性测定：非致病菌为对象，筛选生物活性物质。非致病菌为对象，筛选生物活性物质。耐药和超敏菌种。耐药和超敏菌种。HPLCHPLC、LCLCMSMS等，分析鉴定活性物质。等，分析鉴定活性物质。靶向筛选靶向筛选 高通量筛选高通量筛选 高内涵筛选高内涵筛选发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立微生物药物与菌种的筛选流程微生物药物与菌种的筛选流程样品采集样品采集微生物分离微生物分离培养培养筛选鉴定筛选鉴定筛选方法学建立筛选方法学建立阳性结

5、果阳性结果化合物分离化合物分离纯化鉴定纯化鉴定前药新前药新化合物化合物新新药药研研究究与与开开发发菌种鉴定与保藏菌种鉴定与保藏生产出发菌生产出发菌发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立10.3.1.2 生产选育生产选育 概念：不经过人工诱变处理，根据菌种概念：不经过人工诱变处理，根据菌种的自然突变而进行的菌种筛选过程。的自然突变而进行的菌种筛选过程。应用应用：（1 1）菌种的提纯复壮。（菌种的提纯复壮。（2 2）防）防止退化，稳定生产水平。止退化，稳定生产水平。1 1年年1 1次。次。过程过程菌菌种种单孢单孢子子单菌落单菌落测活测活平板平板分离分离优良优良菌株菌株效率低（效率低（10E5

6、E8），增产幅度小），增产幅度小发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立10.3.1.3 诱变育种诱变育种 概念：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种概念：人为创造条件（诱变剂处理），使菌种发生变异，筛选优良个体，淘汰劣质个体。发生变异，筛选优良个体，淘汰劣质个体。物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。物理类：紫外线，快中子，激光，太空射线。化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。化学类：碱基类似物，嵌合剂，亚硝酸。生物类：噬菌体，转座子。生物类：噬菌体，转座子。v特点：快速，简单，效益大。特点：快速，简单，效益大。v缺点：无定向性，大量筛选。缺点：无定向性，大量筛选。发酵制药发酵制药生产菌种

7、的建立生产菌种的建立诱变方案设计诱变方案设计 出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。出发菌种的选择：较高产，对诱变剂敏感。诱变剂的使用：交叉使用多种，合理组合。诱变剂的使用：交叉使用多种，合理组合。中等剂量（中等剂量（8080致死率）。致死率）。选择压：施加一定的选择压，获得耐药菌株。选择压：施加一定的选择压，获得耐药菌株。措施：添加抗生素，提高前体浓度，增加产措施：添加抗生素，提高前体浓度，增加产物浓度。物浓度。发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立诱变育种流程诱变育种流程出发菌种出发菌种单孢子悬液单孢子悬液稀释涂板稀释涂板单菌落初筛单菌落初筛高产菌株高产菌株诱变处理诱变处理稳定性稳定

8、性特性特性放大放大中试中试复筛复筛投入生产投入生产发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立10.3.1.4 原生质体融合育种原生质体融合育种概念概念通过化学或物理学的方法，使两个不同种通过化学或物理学的方法，使两个不同种类的体细胞融合在一起，形成杂合细胞，类的体细胞融合在一起，形成杂合细胞，产生兼具两个亲本遗传性状的新细胞。产生兼具两个亲本遗传性状的新细胞。特点：有一定的定向性，效果显著。特点：有一定的定向性，效果显著。发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立d.d.筛选，鉴定筛选，鉴定e.e.高产菌株高产菌株a.a.原生质体制备：原生质体制备：用去壁酶处理将微生用去壁酶处理将微生物细

9、胞壁除去，制成物细胞壁除去，制成原生质体。原生质体。操作过程操作过程hybrid cell c.细胞壁再生细胞壁再生b.b.原生质体融合：原生质体融合：异核体或重组子异核体或重组子菌株菌株1 1菌株菌株2 2去细胞壁去细胞壁原生质体原生质体1原生质体原生质体2高渗，高渗，PEGPEG处理处理杂合原生质体杂合原生质体发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立概念：操作对象为单染色体组成的基因组，以原生质概念：操作对象为单染色体组成的基因组，以原生质体融合技术为基础，使基因组整体发生重组形成候选体融合技术为基础，使基因组整体发生重组形成候选突变库，经过筛选得到生产途径和表型改进的菌种，突变库，经

10、过筛选得到生产途径和表型改进的菌种，即经济适用的菌种。即经济适用的菌种。特点：短时、快速，定向特点：短时、快速，定向应用：效果很显著应用：效果很显著10.3.1.510.3.1.5基因组基因组shufflingshuffling发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立基因组Shuffling过程 突变：随机突变获得单个性状优良的菌株突变：随机突变获得单个性状优良的菌株 重组：多个菌株的原生质体混合、融合、再重组：多个菌株的原生质体混合、融合、再生，形成第一个融合库（生，形成第一个融合库（F1F1）筛选鉴定：获得有益突变积累的新性状菌株筛选鉴定：获得有益突变积累的新性状菌株 多轮循环：再次融

11、合，得到融合库多轮循环：再次融合，得到融合库F2F2、F3F3、F4F4.,.,筛选鉴定筛选鉴定 结果：消除有害突变，组合有益突变新菌种结果：消除有害突变，组合有益突变新菌种发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立例1：改良青霉菌生产青霉素的产量随机突变育种方法：X-射线(X)紫外线(UV)氮芥(N)120 units2658 units发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立toothpick1.01.251.251.01 菌落菌落1 菌落菌落0.5 ml2.510 菌落菌落10 菌落菌落CKE.coliINVaF0.5E.coliINVaF-80 stocktoothpick0.5

12、ml 0.5ml 1.251.51.52.02.02.5-80 stock2 菌落菌落-80 stock例例2：菌种筛选示意图（选择压逐步增加）：菌种筛选示意图（选择压逐步增加）发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立生长曲线生长曲线(选择压选择压2.5M)黑色：出发菌种黑色：出发菌种;蓝色：耐蓝色：耐0.50.5绿色：耐绿色：耐1.25;1.25;红色：耐红色：耐2.52.5发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立例3：提高泰乐菌素生产能力突变育种 基因组shuffling出发菌种效果Zhang YX,et al.,Nature,415(6872):644-666.发酵制药发酵制药生

13、产菌种的建立生产菌种的建立1年，24,000 次分析发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立10.3.2 菌种保藏菌种保藏原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，原因：菌种经过多次传代，会发生遗传变异，导致退化，从而丧失生产能力甚至菌株死亡。从而丧失生产能力甚至菌株死亡。目的：目的：保持菌种保持菌种原有原有优良特性优良特性，延长生命时限，延长生命时限，长期存长期存活、不退化，不污染，随时为生产供菌。活、不退化，不污染，随时为生产供菌。原理：使菌种代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制原理：使菌种代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制的休眠状态。的休眠状态。措施：物理和化学方法（温度：

14、低温；水分：干燥；氧措施：物理和化学方法（温度：低温；水分：干燥；氧气：缺氧；营养；缺乏）气：缺氧；营养；缺乏）发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立保藏方法比较保藏方法比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法沙土保藏法冷冻干燥法低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各类细菌、酵母菌各类产孢子微生物各类36月612月12年110年515年以上简便简便简便简便有效简便有效发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立10.3.3 菌种库建立与质量控制 依据：GMP对药品生产的有关要求和规定建立各级种子细胞库，实施种子批系统管理

15、，进行验证确保菌种的稳定、无污染，保证生产正常有序进行。发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立建库的流程W CBQCW CBQCQCMCB新菌种或细胞系原始培养物QC质保实验室，繁殖保存实验室，繁殖主菌种库MCB：来源于原始菌种或细胞培养物工作菌种库WCB：由主菌种库或主细胞库繁殖而来。发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立菌种库的质量管理菌种库的质量管理细胞类型质量控制（QC）内容细菌活性，纯度，真实性，革兰氏染色，形态特征，生化特征，遗传特征真菌活性，纯度，真实性，形态特征，生化特征，遗传特征基因工程菌宿主菌特征，表达质粒结构与功能，鉴别标志，基因序列，稳定性，表达方式与水平动

16、物细胞系活性，纯度，真实性，无菌实验，核型，DNA分析（如指纹图谱），同工酶分析，支原体试验，其他外源物试验，稳定性和基因型分析发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立保藏机构中国保藏机构中国中国典型培养物保藏中心中国典型培养物保藏中心:China Center for Type:China Center for Type Culture Collection(CCTCC)Culture Collection(CCTCC)。中国科学院典型培养物保藏委员会中国科学院典型培养物保藏委员会,下设下设9 9个库个库中国普通微生物菌种保藏管理中心：中国普通微生物菌种保藏管理中心：China Gene

17、ral China General Microbiological Culture Collection Center Microbiological Culture Collection Center(CGMCC)(CGMCC)，微生物所（真菌和细菌）；武汉所（病毒），微生物所（真菌和细菌）；武汉所（病毒）抗生素菌种保藏管理中心（抗生素菌种保藏管理中心（CACCCACC）：中国医学科学院抗）：中国医学科学院抗生素所，四川抗生素所，华北制药集团抗生素所生素所，四川抗生素所，华北制药集团抗生素所发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立保藏机构国外保藏机构国外 WFCCWFCC：World f

18、ederation for culture World federation for culture collections,collections,http:/www.wdcm.riken.go.jp/wfcc.thmlhttp:/www.wdcm.riken.go.jp/wfcc.thml 美国的典型菌种保藏中心美国的典型菌种保藏中心ATCC:American ATCC:American Type Culture Collection,Type Culture Collection,http:/www.atcc.org/http:/www.atcc.org/日本发酵研究所日本发酵研究所IF

19、O:Institute for IFO:Institute for Fermentation,Osaka,JapanFermentation,Osaka,Japan 英国国家典型菌种保藏所英国国家典型菌种保藏所NCTC:National NCTC:National Collection of Type Culture,London,UK Collection of Type Culture,London,UK 发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立小结与要求 生产菌种选育：自然分离获得出发菌种，生生产菌种选育：自然分离获得出发菌种，生产选育、诱变和原生质体融合、产选育、诱变和原生质体融合

20、、Shuffling，提高菌种生产性能提高菌种生产性能 菌种保藏：防止失活和退化（物理手段）菌种保藏：防止失活和退化（物理手段）建立菌种库：建立菌种库：GMP的要求，质量控制，保证的要求，质量控制，保证生产菌种活力和供给生产菌种活力和供给了解菌种选育和保存的方法及其原理了解菌种选育和保存的方法及其原理理解其生产应用价值，掌握突变和原生质体育种技术理解其生产应用价值，掌握突变和原生质体育种技术能设计育种研究方案和能实际应用。能设计育种研究方案和能实际应用。发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立思考题思考题（1 1）如何进行生产菌的分离与筛选？）如何进行生产菌的分离与筛选？（2 2）比较各种菌种选育方法的优缺点。）比较各种菌种选育方法的优缺点。（3 3）菌种保藏的原理是什么？有那些主）菌种保藏的原理是什么？有那些主要方法，各有何优缺点？要方法，各有何优缺点？发酵制药发酵制药生产菌种的建立生产菌种的建立