生物分离与纯化实验课件.ppt

1、生物分离与纯化实验生物分离与纯化实验共共34学时学时n持续改进n协作n实验报告：1.信息栏填全，遗漏项：同组人员；2.结果计算：过程完整 3.讨论分析不可缺项，内容丰满，见解细致。上次实验总结上次实验总结实验（三）血清中抗体纯化（实验（三）血清中抗体纯化（16学时）学时）配基 特异性Protein A许多IgGs 的Fc 片断Protein G许多IgGs 的Fc 片断Antigen特异的抗体Anti-IgG特异免疫球蛋白抗体纯化配基类型 族特异性族特异性专一特异性二、实验原理二、实验原理用用 rProtein A Sepharose 分离分离IgGColumn:HiTrap Protein

2、A FF结合缓冲液:20 mM 磷酸钠,pH 7.0洗脱缓冲液:0.1 M 甘氨酸-HCl,pH 3注意:为了保护抗体的活性，将洗脱组分收集于 1 M Tris-HCl,pH 7.5中二、实验原理二、实验原理种属种属蛋白蛋白 A 蛋白蛋白 G结合结合结合结合人人IgA可变的可变的-IgD-IgEIgG1+IgG2+IgG3-+IgG4+IgM*可变的可变的-鸟类蛋黄鸟类蛋黄IgY-牛牛+狗狗+山羊山羊-+豚鼠豚鼠IgG1+IgG2+仓鼠仓鼠+马马+考拉考拉-+骆驼骆驼-+种属种属蛋白蛋白 A 蛋白蛋白 G结合结合结合结合恒河猴恒河猴+大鼠大鼠IgG1+IgG2a+IgG2b+IgG3+IgM*

3、可变的可变的-猪猪+兔兔+小鼠小鼠IgG1-+IgG2a-+IgG2b-+IgG3+绵羊绵羊+/-+相对结合强度相对结合强度 弱或不结合弱或不结合三、实验材料三、实验材料纯化纯化试剂：试剂：磷酸二氢钠、磷酸氢钠、氯化钠、异地酸二钠、枸橼酸、精氨酸、盐酸胍、氢氧化钠、95%乙醇；均为分析纯。容器：容器：50ml烧杯/三角瓶/试管10个；15ml收集试管5个；100ml三角瓶 5个；250ml烧杯5个填料：填料：Protein A层析柱层析柱：XK10或预充柱装柱体积装柱体积：2ml血清血清：2ml滤器：0.45m针头式滤器5个；SDS-PAGE:缓冲液：平衡液：20mM磷酸二氢钠，150mM氯化

4、钠，pH7.2；(1L)冲洗液：20mM磷酸二氢钠，0.5M氯化钠，10mM EDTA二钠，pH7.2；(1L)洗脱液：0.1M Glycine-HCl，pH3.5；(1L)清洗液：6mM氢氧化钠。(1L)稀释血清：取2ml血清，用平衡缓冲液稀释5倍，0.45um针头滤器过滤。标记为S.三、实验材料三、实验材料纯化纯化三、实验材料三、实验材料SDS-PAGE试剂：试剂：1.2x样品缓冲液2.凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml，过滤。3.pH8.9分离胶缓冲液：Tris 36.3g，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml

5、使其溶解，调pH8.9，定容至100ml，4保存。4.pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris 5.98g，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml，4保存。5.TEMED（四乙基乙二胺）原液6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）7.pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4保存，临用前稀释10倍（减半配制）。8.考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到2

6、50ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。器材：器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。三、实验试剂三、实验试剂浓度测定浓度测定考马斯亮蓝G-250蛋白染色液(1)牛血清白蛋白标准液（100ug/ml）精确称取0.010g牛血清白蛋白，溶于约50ml蒸馏水，定容到100ml.(2)考马斯亮蓝G-250试剂 取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%正磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，此试剂在常温下可放1个月。四、实验步骤四、实验步骤1.Protein A纯化：1）装柱：固定好层析柱，柱保持垂直，夹上出入口止水夹，量取20ml蒸馏水加入柱内，在柱外做一体积为20

7、ml的标记，然后打开止水夹赶去出口内气泡，最后在柱内保留0.5-1m的水。ProteinA填料中加入适量平衡缓冲液，小心搅起凝胶，尽量一次加入柱内，待上层有一水层后打开止水夹，再用20-40ml平衡缓冲液不断加入柱内洗脱，最后待胶床表面仅有1-2厘米液层时，旋紧止水夹。装好的胶柱应符合无气泡、无节痕、床面平正。2）上样：血清让胶床表面几乎不留液层，然后小心注入床面中央2ml稀释血清，待样液几乎全部进入胶床表面后，关止水夹，室温下样品与填料结合15min。实验步骤1.Protein A纯化：3）冲洗：加2倍柱体积冲洗缓冲液，打开止水夹，控制流出速度为2ml/min，并用试管收集流出液(记为W)，

8、在床表面仅有1毫米左右液层时，关止水夹，再加入2倍柱体积平衡缓冲液冲洗填料，床表面仅有1毫米左右液层时，关止水夹，。4）洗脱收集：取刻度试管2支编号，柱床上面加3倍柱体积洗脱缓冲液，控制止水夹流出1倍柱体积洗脱液后，关止水夹，室温下柱料与洗脱液孵育15min，打开止水夹控制流出速度为1ml/min收集2倍柱体积（记为E1），待床表面仅有1毫米左右液层时再加入3倍柱体积洗脱缓冲液，收集2倍柱体积记为E2。5）收集结束后，加入清洗液（6M NaOH）洗涤2cv，平衡液5cv。离胶离胶及浓缩胶的及浓缩胶的制备制备：1 将玻璃板、样品梳、将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用洗涤剂洗净，用用d

9、dH2O 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；2 将两块洗净的玻璃板之间加入将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照按照说明书说明书提示装好玻璃板提示装好玻璃板；3 按以下配置按以下配置10%分离胶及浓缩胶分离胶及浓缩胶四、实验步骤四、实验步骤2.SDS-PAGE 纯度测定纯度测定浓缩胶浓缩胶（5 ml）双蒸水双蒸水0.5 mol/L pH 6.8Tris-HCl30%胶胶贮液贮液10%SDSTEMED 10%AP5%3.4ml0.63 ml0.83ml50 l5 l50 l分离胶分离胶（10 ml）双蒸水双蒸水1.5 mol/L pH 8.8Tris-HCl胶贮液

10、胶贮液10%SDSTEMED10%AP7.5%12%10%4.8ml3.3ml4.0ml2.5ml2.5 ml2.5ml2.5ml4 ml3.3 ml100 l100 l100 l10 l10 l10 l100 l100 l100 l3、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5 cm左右，之后加少许蒸馏水，静置30分钟。凝胶配制过程要迅速，催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。4、倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至

11、离边缘5 mm处，迅速插入样梳，静置10分钟。样梳需一次平稳插入，梳口处不得有气泡，梳底需水平。四、实验步骤四、实验步骤2.SDS-PAGE 纯度测定纯度测定5、样品处理：还原样品：取30ul样品（S,W,E1 E2），加入30ul 还原上样缓冲液，100水浴5min，非还原样品加入30ul非还原上样缓冲液室温孵育5min。6、加样：拔出样梳后，空出第一个孔，从第二个开始按已编排好的顺序依次加入相应体积的样品和蛋白Marker。其中S和Marker加样量为2 l，W,E1，E2加样量为15 l，还原与非还原样品间空一孔道。注射器不可过低，以防刺破胶体，也不可过高，在样下沉时会发生扩散。为避免边

12、缘效应，最好选用中部的孔注样。四、实验步骤四、实验步骤2.SDS-PAGE 纯度测定纯度测定7、电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电压恒定在160 V，当进入分离胶后改为240 V，溴酚蓝距凝胶边缘约5 mm时，停止电泳。8、凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，然后放在大培养皿内，加入染色液微波煮沸后，染色10min左右。剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分。9、脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水冲洗染色液，再用微波煮沸后的脱色液脱色，可更换2次，直到蛋白质区带清晰。四、实验步骤四、实验步骤2.SDS-PAGE 纯度测定纯度测定实验步骤

13、实验步骤3.蛋白质含量测定蛋白质含量测定1）取洗脱液E1，E2 0.5毫升，用蒸馏水稀释至5毫升，然后吸取稀释后的酶洗脱液G-25 0.5毫升，用考马斯亮蓝G-250染色法测定其蛋白质含量。01234567100ug/ml牛血清蛋白标准液(ml)0.20.40.60.81.0 样品待测液(ml)0.50.5蒸馏水(ml)1.00.80.60.40.2 0.50.5考马斯亮蓝G-2505.05.05.05.05.05.05.05.0各管均匀，室温下放置5分钟，在=595n处比色吸光度（OD595）蛋白质含量（ug）020406080100 A595 标准曲线的制作和样品的测定将凝胶至于薄板上（水润避免破损），并至于白色背景上，用直尺量取marker中各条带距离分离胶前沿的距离，以对应的分子量绘制分子量标准曲线：以量取溶菌酶的迁移距离带入公式中计算分子量分析抗体的纯度及分子量（还原，非还原）计算抗体总蛋白得率。五、结果五、结果下面开始实验！下面开始实验！