等位基因特异性PCR原理和应用课件.ppt

1、等位等位基因基因特异性特异性PCR 的的原理与应用原理与应用2015.1.161PPT课件内容概要内容概要基本原理基本原理实验方法实验方法临检项目临检项目KRAS、EGFR突变检突变检测测科研应用科研应用BSG位点分型位点分型2PPT课件等位等位基因基因特异性特异性PCRPCR的基本原理的基本原理3PPT课件单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（SNP）检测方法）检测方法限制性酶切片段长度多态性限制性酶切片段长度多态性（RFLP）单链构象单链构象多态性多态性（SSCP）变性高效液相色谱变性高效液相色谱（DHPLC）异源双链分析异源双链分析（HA）基质辅助激光解吸飞行时间质谱基质辅助激光解吸飞行时间质

2、谱（MALDI-TOF MS）动态等位基因特异性杂交动态等位基因特异性杂交（DASH）基因芯片法基因芯片法TaqMan探针技术探针技术焦磷酸测序法焦磷酸测序法4PPT课件？操作繁琐操作繁琐耗时长耗时长产物污染产物污染灵敏度低灵敏度低仪器昂贵仪器昂贵5PPT课件等位基因特异性等位基因特异性PCR等位基因特异性等位基因特异性 PCR（Allele Specific-PCR，AS-PCR）又称扩增阻碍突变系统又称扩增阻碍突变系统PCR（Amplification Refractory Mutation System-PCR，ARMS-PCR）PCR扩增过程中，引物从3末端开始延伸，要求3端碱基与模板

3、完全配对6PPT课件等位基因特异性等位基因特异性PCR基本基本原理原理You F.M.2008,BMC BioinformaticsTwo Allele-Specific(AS)primers,one for each allele of a SNP are designed.The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3 end.Two sets of primers,either forward or reverse primers can be designed.If a common r

4、everse or forward primer is used in a PCR reaction,the reaction is called allele-specific PCR(AS-PCR).7PPT课件四引物法四引物法ARMS-PCR单管反应8PPT课件凝胶电泳凝胶电泳耗时长耗时长开管操作开管操作易污染易污染缺陷：缺陷：9PPT课件使用荧光定量使用荧光定量PCR检测检测10PPT课件real time PCR速度快速度快闭管操作闭管操作不易污染不易污染11PPT课件等位基因特异性等位基因特异性PCR技术技术特点特点灵敏度高灵敏度高（0.1-1%0.1-1%）操作简便操作简便周期短

5、周期短不产生不产生PCR产物污染产物污染适用样本类型多（如（如FFPE）精确突变类型精确突变类型方法建立需时较长方法建立需时较长仅能检测已知突变仅能检测已知突变适用于临床检验适用于临床检验优点缺点12PPT课件测序法与测序法与等位基因特异性等位基因特异性PCR法比法比较较SangerSanger测序法测序法焦磷酸测序焦磷酸测序ARMS敏感度敏感度10-20%5-10%1%FFPEFFPE标本成功率标本成功率 低低较高较高高高商用试剂盒商用试剂盒无无有有有有流程与速度流程与速度1-21-2天天2-3天天1天天数据分析要求数据分析要求高高高高低低试剂成本试剂成本低低低低略高略高仪器成本仪器成本高高

6、高高低低13PPT课件等位等位基因基因特异性特异性PCR的的实验方法实验方法14PPT课件操作流程及数据解读操作流程及数据解读15PPT课件实验操作实验操作收到样本之后：收到样本之后：16PPT课件试剂盒试剂盒（以友芝友（以友芝友EGFR试剂盒为例）试剂盒为例）编号编号位点位点内容内容规格规格1G719XPCR缓冲液、缓冲液、G719X引物探针、内标、参比染料引物探针、内标、参比染料ROX23l2S768IPCR缓冲液、缓冲液、S768I引物探针、内标、参比染料引物探针、内标、参比染料ROX23l3T790MPCR缓冲液、缓冲液、T790M引物探针、内标、参比染料引物探针、内标、参比染料ROX

7、23l4L858RPCR缓冲液、缓冲液、L858R引物探针、内标、参比染料引物探针、内标、参比染料ROX23l5L861QPCR缓冲液、缓冲液、L861Q引物探针、内标、参比染料引物探针、内标、参比染料ROX23l6INSPCR缓冲液、缓冲液、Ins引物探针、内标、参比染料引物探针、内标、参比染料ROX23l7DELPCR缓冲液、缓冲液、Del引物探针、内标、参比染料引物探针、内标、参比染料ROX23l8质控（外控）质控（外控）PCR缓冲液、质控引物探针、内标、参比染料缓冲液、质控引物探针、内标、参比染料ROX23l突变探针：突变探针：FAM荧光标记；内标探针：荧光标记；内标探针：VIC荧光标

8、记荧光标记17PPT课件PCR扩增扩增ABI7500开机，仪器自检；开机，仪器自检；将准备好的将准备好的8连管放置在仪器样品槽相应位置，并记录放置顺序；连管放置在仪器样品槽相应位置，并记录放置顺序；信号采集：信号采集：EGFR基因：基因：FAM通道；内标：通道；内标：VIC通道；通道；PCR反应条件：反应条件：37：10分钟分钟95：5分钟分钟95：15秒秒60：60秒秒核酸扩增区核酸扩增区4040循环循环18PPT课件阴性对照和阳性对照阴性对照和阳性对照阴性对照（空白对照）阴性对照（空白对照）应应无无FAMFAM荧光信号产生，或荧光信号产生，或CtCt值值3838 阳性对照（弱阳性对照）阳性

9、对照（弱阳性对照）FAMFAM通道通道CtCt值值3232，VICVIC通道通道CtCt值值3838，但可能会由于不同仪器的不同阈值设但可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。置而发生波动。无无DNA污染污染验证验证PCR有效性有效性19PPT课件样品的外控和内控样品的外控和内控待测样品的外控（待测样品的外控（8 8号管号管FAMFAM信号曲线）应有信号曲线）应有FAMFAM信号信号 以友芝友试剂盒为例：以友芝友试剂盒为例：FAMFAM通道通道23Ct23Ct值值3030；待测样品的内控（待测样品的内控（1-71-7号管的号管的HEX/VIC/JOEHEX/VIC/JOE信号曲线）应有扩增

10、曲线信号曲线）应有扩增曲线 以友芝友试剂盒为例：样品检测中以友芝友试剂盒为例：样品检测中VICVIC通道通道CtCt值值3838。Ct23：DNA加加入过量入过量30Ct38或无或无Ct值值Ct389Ct3838或无或无Ct值值Ct388Ct3838或无或无Ct值值Ct388Ct3838或无或无Ct值值Ct387Ct3838或无或无Ct值值Ct387Ct3838或无或无Ct值值Ct387Ct3838或无或无Ct值值Ct387Ct387 Ct=突变检测突变检测Ct 内控检测内控检测Ct以友芝友以友芝友EGFREGFR试剂盒为例试剂盒为例21PPT课件临检项目临检项目KRAS22PPT课件KRAS

11、背景背景KRAS是一种原癌基因，长约是一种原癌基因，长约35kb，位于，位于12号染色体，是号染色体，是RAS基因家基因家族成员之一，编码的蛋白主要参与族成员之一，编码的蛋白主要参与PI3K、PTEN、AKT和和RAF、MEK、ERK信号通路的调控；信号通路的调控；EGFR在通路中位于在通路中位于KRAS上游，配体与之结合后可以激发其酪氨酸激上游，配体与之结合后可以激发其酪氨酸激酶活性，导致酶活性，导致KRAS的活化和通路中信号传导；的活化和通路中信号传导；KRAS是许多恶性肿瘤的常见突变基因：胰腺癌（是许多恶性肿瘤的常见突变基因：胰腺癌（65%-90%）、结直）、结直肠癌（肠癌（40%）、肺

12、癌（）、肺癌（20%）、卵巢癌（）、卵巢癌（15%）。）。23PPT课件KRAS基因突变影响结直肠癌药物疗效基因突变影响结直肠癌药物疗效KRAS基因野生型的转移性结直肠癌患者能从基因野生型的转移性结直肠癌患者能从EGF抗体（抗体（西妥昔单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗帕尼单抗）治疗中获益，而基因突变的患者治疗效果很差；）治疗中获益，而基因突变的患者治疗效果很差；KRAS突变型患者对西妥昔单抗无应答，其总体生存期明显低于突变型患者对西妥昔单抗无应答，其总体生存期明显低于KRAS野生型患者野生型患者Karapetis CS,2008,N Eng J Med24PPT课件结直肠癌患者检测结直肠癌患者检测K

13、RAS突变相关指南突变相关指南欧洲药品评估局（欧洲药品评估局（EMEA，2008）指出：）指出：KRAS野生型的进展期结直肠癌患者可能从野生型的进展期结直肠癌患者可能从帕尼单抗中受益，而突变型患者受益较少。帕尼单抗中受益，而突变型患者受益较少。美国临床肿瘤学会（美国临床肿瘤学会（ASCO，2009）推荐：）推荐：转移性结直肠癌患者应检测转移性结直肠癌患者应检测KRAS突变，突变，如有如有KRAS12、13位突变，则不应进行位突变，则不应进行EGFR单克隆抗体治疗单克隆抗体治疗；美国美国FDA指南推荐：在使用靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结肠直肠癌前指南推荐：在使用靶向药物西妥昔单抗和帕

14、尼单抗治疗转移性结肠直肠癌前必须检测必须检测KRAS基因的基因型；基因的基因型；2012年年7月月6日批准第一个用于结直肠癌的基因检测日批准第一个用于结直肠癌的基因检测（Qiagen），以判断西妥昔单抗是否有效；），以判断西妥昔单抗是否有效；美国国立综合癌症网络（美国国立综合癌症网络（NCCN，2014）指南说：）指南说：转移性结直肠癌患者均应进行转移性结直肠癌患者均应进行RAS突变检测（突变检测（KRAS和和NRAS），至少应检测），至少应检测KRAS第二外显子的突变情况第二外显子的突变情况。KRAS或或NRAS突变型的病人不应采取西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。突变型的病人不应采取西妥昔单抗或帕

15、尼单抗治疗。中国卫生部于中国卫生部于2010年年10月月14日发表了结直肠癌诊疗规范（日发表了结直肠癌诊疗规范（2010版）版）。明确指出。明确指出在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受西妥昔单抗西妥昔单抗、帕尼单抗时，必须检测肿瘤组、帕尼单抗时，必须检测肿瘤组织的织的K-ras基因状态。在晚期基因状态。在晚期/转移性结直肠癌化疗中，在治疗前检测肿瘤转移性结直肠癌化疗中，在治疗前检测肿瘤 K-ras 基因基因状态，状态，EGFR不推荐作为常规检查项目。不推荐作为常规检查项目。25PPT课件KRAS突变影响非小细胞肺癌药物疗效突变影响非小细胞肺癌药物疗效KRAS

16、基因野生型的非小细胞肺癌患者能从小分子酪氨酸激酶抑制剂基因野生型的非小细胞肺癌患者能从小分子酪氨酸激酶抑制剂（TKI，如吉非替尼、厄洛替尼，如吉非替尼、厄洛替尼）治疗中获益，而基因突变的患者易）治疗中获益，而基因突变的患者易发生抵抗。发生抵抗。KRASKRAS突变型患者使用厄洛替尼联合化疗后，其无症状生存期和总生存期明显低于野生型突变型患者使用厄洛替尼联合化疗后，其无症状生存期和总生存期明显低于野生型患者（图中红线所示）患者（图中红线所示）Anderson SM,2011,Expert Rev.Mol.Diagn Eberhard DA,2005,J Clin Oncol 26PPT课件非小细

17、胞肺癌患者检测非小细胞肺癌患者检测KRAS突变相关指南突变相关指南美国国立综合癌症网络（美国国立综合癌症网络（NCCN，2009）指出，）指出，KRAS突变与非小细胞突变与非小细胞肺癌患者肺癌患者TKI抵抗有关，抵抗有关，KRAS基因测序有助于确定哪些病人适合基因测序有助于确定哪些病人适合TKI治疗。当治疗。当KRAS基因发生了突变，则不建议病人使用厄洛替尼进行分子基因发生了突变，则不建议病人使用厄洛替尼进行分子靶向治疗。靶向治疗。27PPT课件KRAS主要突变位点主要突变位点在结直肠癌中，在结直肠癌中，KRAS突变主要发生于突变主要发生于codon12(80%)、codon13(15-20%

18、)、codon61和和146(C6239G719S182155GA6252G719C182155GT6253E746-A750del(1)192235-2249del156223E746-A750del(2)192236-2250del156225L747-P753S192240-2257del1812370E746-A750I192235-2252AAT(complex)13551E746-A750del192235-2253del1812728E746-A750A192237-2251 del1512678E746-S752A192237-2254 del1812367E746-S752V

19、192237-2250 T(complex)12384E746-S752D192238-2255 del186220L747-A750P192238-2248 GC(complex)12422L747-T751Q192238-2252 GCA(complex)12419L747-E749del192239-2247del96218L747-T751del192239-2253del156254L747-S752del192239-2256del186255L747-A750P192239-2248TTAAGAGAAG C12382L747-P753Q192239-2258CA(complex)

20、12387L747-T751S192240-2251del126210L747-T751del192240-2254del1512369L747-T751P192239-2251 C(complex)12383T790M202369C T6240S768I202303GT6241V769-D770insASV202307-2308 ins GCCAGCGTG12376H773-V774insH202319-2320 ins CAC12377D770-N771insG202310-2311 ins GGT12378L858R212573TG6224L861Q212582TA621336PPT课件

21、EGFR突变与突变与EGFR-TKI药物疗效关系药物疗效关系所在外显子所在外显子突变类型突变类型与与EGFR-TKI疗效关系疗效关系18G719A(S/C)3种点突变种点突变药敏突变药敏突变1919种缺失突变种缺失突变药敏突变药敏突变20点突变点突变S768I药敏突变药敏突变20点突变点突变T790M耐药突变耐药突变*203种插入突变种插入突变耐药突变耐药突变*21点突变点突变L858R药敏突变药敏突变21点突变点突变L861Q药敏突变药敏突变37PPT课件EGFR18-21外显子突变位点检测外显子突变位点检测结果结果19外显外显子缺失子缺失21外显子外显子L858R突变突变38PPT课件科研

22、应用科研应用BSG分型分型39PPT课件Basigin（BSG）及其功能）及其功能lBasigin（BSG，CD147/EMMPRIN）为单次跨膜糖蛋白，在体内多）为单次跨膜糖蛋白，在体内多种细胞中广泛表达；种细胞中广泛表达；l炎症与非炎症性心肌病患者心肌细胞炎症与非炎症性心肌病患者心肌细胞Basigin表达水平升高；表达水平升高；l充血性心力衰竭的患者中充血性心力衰竭的患者中MMP-9和和Basigin蛋白表达水平显著升高，蛋白表达水平显著升高，且二者表达水平呈正相关；且二者表达水平呈正相关；l目前无人类目前无人类BSG基因多态性与慢性充血性心衰易感性基因多态性与慢性充血性心衰易感性关系的研

23、究。关系的研究。40PPT课件如何基因分型？如何基因分型？PCR-RFLP4个位点个位点800样本样本200多块胶多块胶数百小时数百小时MALDI-TOF800样本样本4个位点个位点数万元数万元41PPT课件ARMS法设计引物法设计引物ARMS引物：引物：野生型：野生型：CTGAGTGGGGCCAGT突变型：突变型：CTGAGTGGGGCCAGC下游引物：下游引物：CCCCGAATACTGAAG产物产物192bp42PPT课件总结总结 等位基因特异性等位基因特异性PCR是一种操作简便、灵敏度高、无后续是一种操作简便、灵敏度高、无后续产物污染的产物污染的SNP检测方法；检测方法；适用于临床检验和科研项目。适用于临床检验和科研项目。43PPT课件Thank You！44PPT课件