1、分子克隆与蛋白纯化分子克隆与蛋白纯化一.载体构建也就是基因重组技术，主要包括：目的基因的获取 克隆载体的选择 外源基因与载体的连接 重组DNA导入受体菌 重组体的筛选 克隆基因的表达 1.目的基因的获取化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。基因组DNA文库cDNA文库PCR2.克隆载体的选择选择克隆载体的几个重要参数 1）实验对象(供体和受体)2）实验性质（实验的目的）3）载体容量（M13mp载体 细菌质粒载体 10kb载cos质粒载体pYAC载体1000 kb）4）合适克隆位点 5）载体的稳定性 6）载体DNA制备的难易 7）外源基因表达产物产量、产物特点等3.外源基因与载
2、体的连接最常用的是粘性末端连接同一限制酶切位点连接，要考虑以下三个方面：载体总量，载体和插入片段比例，载体和插入片段质量。4.重组DNA导入受体菌我们使用的是转化的方式，受体菌处于感受态。要注意的是复苏的LB培养基必须无菌而且没有抗生素5.重组体的筛选提质粒，酶切或PCR验证；菌液PCR；测序。6.克隆基因的表达 我们用试表达的方法来验证是否构建成功。如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。二二.蛋白分离与纯化蛋白分离与纯化 我们主要研究膜蛋白，由于它表达量少，不溶于水溶液，这就增加了工作的难度。即使使用E.coli过表达也很难满足研究的需要
3、。不溶于水，使用去污剂来维持它的稳定性，工作难度成指数级增加。主要内容 大批量的培养细菌和收菌；细胞破碎和膜沉淀；溶膜（用去污剂将膜蛋白从膜中提取出来）；膜蛋白纯化。大批量的培养细菌和收菌 使用已转化的表达系进行蛋白的过量表达，在培养基中添加相应的抗生素和诱导剂。诱导在稳定期进行（大约在56h），诱导后3h就可以收菌了。细胞破碎和膜沉淀 使用超声破碎的方法将细胞破碎，结合冻融的方法效果会更好。如果超声破碎不充分，大量的DNA会使溶液很粘稠，将会影响到蛋白的纯度。细胞破碎后要立即进行膜沉淀，将膜分离出来。溶膜 这是膜蛋白研究工作中最关键的一步，根据自己蛋白的性质选择合适的去污剂是实验成功的关键。
4、本质上就是用去污剂去置换膜上包裹蛋白的磷脂。膜蛋白纯化 我们表达的蛋白是加了His-tag的，这就是纯化变得很方便，应用可以吸附组氨酸的咪唑基团而将目的蛋白分离出来。在所有的纯化过程中，去污剂的浓度都要高于（）在纯化过程中的添加的甘油可以提高膜蛋白的稳定性。使用离子交换色谱和凝胶色谱可以获得很纯的蛋白。三蛋白结晶三蛋白结晶我们的目的就是要拿到晶体，而且还是要分辨率高的晶。这是一个很难掌握的一步，就像是在大海捞针一样，使用不同的和不同的去污剂进行大量的筛选，如果幸运的话，某个条件有晶体出现，就要在这个条件下进行优化，包括盐浓度，缓冲液和。蛋白结晶是整个研究的瓶颈，这时值就显的特别重要。四解结构将晶体进行x射线衍射，收集衍射图谱，通过一系列的计算，很快就能得到蛋白质的原子结构。感谢聆听！
