十一章-免疫学的应用课件.ppt

1、第一节免疫学检测第一节免疫学检测n免疫学检测是以特异性抗原-抗体反应为基础的检测方法。n具有很高的灵敏度和能快速提供检测结果等优点。基本概念基本概念n抗原（antigen）：指能在机体中引起特异性免疫应答反应，同时又能与免疫应答物（如抗体）产生特异性结合的物质。n抗体（antibody)：是机体经抗原刺激由免疫活性细胞产生的一组免疫球蛋白。n抗原决定簇：是指抗原表面决定抗原特异性的某些特定化学结构，抗原以此与相应抗体结合 n药物分子的抗原性 蛋白、多肽、激素类药物具有免疫原性及抗原特异性。小分子药物无免疫原性，但具抗原特异性，称为为半抗原。抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点n特异性n抗原抗体

2、反应的可见性n适当的比例和浓度n可逆性1、利用已知抗原检测未知抗体、利用已知抗原检测未知抗体（1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病：伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。（2）检测自身抗体诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节炎等2、利用已知抗体检测未知抗原、利用已知抗体检测未知抗原（1）鉴定病原菌：诊断疾病（2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌（3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定（4）检测药物半抗原：确认运动员是否服用兴奋剂抗原或抗体的检测方法抗原或抗体的检测方法 凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应免疫标记技术免疫标记技术一）凝集反应（一）凝集反应（agglutina

3、tionagglutination）细菌的鉴定和血型的检查细菌的鉴定和血型的检查一、一、传统免疫分析传统免疫分析检测病原体可溶性抗原，病原体感染后产生的抗体检测病原体可溶性抗原，病原体感染后产生的抗体2、双向免疫扩散（、双向免疫扩散（doule immunodiffusion）：）：抗原与抗体在琼脂板中相互扩散而形成一定类型的沉淀线的抗原与抗体在琼脂板中相互扩散而形成一定类型的沉淀线的方法。方法。常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析。性分析。1 1）简易免疫电泳）简易免疫电泳先将抗原样品在琼脂中进行电泳分离，可将蛋白质抗原分子分成不

4、同的区带，然后将抗血清加入琼脂板横槽中，使二者进行双向扩散，当比例合适时即形成特异性的沉淀线，2 2）对流免疫电泳）对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis,CIEP)是将双向免疫扩散与电泳相结合的一种技术3 3）火箭免疫电泳）火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis)(rocket immunoelectrophoresis)，抗原在电场下通过含有一定量抗体的琼脂凝胶，并于抗体发生反应，形成沉淀带。可定量分析。用用标记物标记抗体或抗原标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性疫学诊断的

5、敏感性1抗体制备。抗体制备。n多克隆抗体n单克隆抗体，2 2标记物与标记方法。标记物与标记方法。放射性同位素、酶、荧光分子、化学和生物发光系统。免疫分析基本环节免疫分析基本环节 3分析方式设计：分析方式设计：非竞争方式、竞争方式；直接法、间接法；标记抗原、标记抗体；均相、非均相4.4.信号检测。信号检测。与相应的标记物对应。主要为分光光度法、荧光光度法、化学发光检测法。利用放射性同位素的测量方法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术。特点：灵敏度高、特异性强、样品用量少灵敏度高、特异性强、样品用量少、标记物容易制备以及放射性强度容易检测1.放射免疫分析必需的基本试剂：放射免疫分析必需的基

6、本试剂：n抗体：抗体：作为标记药物和非标记药物竞争结合的蛋白。n标记药物：标记药物：提供可检测的信号(响应值)（放射性、光吸收、荧光发射）。n非标记药物：非标记药物：在标准曲线制备时是药物标准品，(在样品中则为被测药物)n分离剂分离剂分离结合与游离部分结合相游离相标记药物(S*)+抗体(Ab)标记药物-抗体复合物(S*-Ab)F*P-B*B*F*、B*分别是游离的和与抗体结合的标记药物浓度，它们可通过产生的信号(如放射性、光吸收、荧光发射)强度反映出来(用仪器检测)。非标记药物（S）F +标记药物(S*)+抗体(Ab)标记药物-抗体复合物(S*-Ab)F*P-B-B*B*非标记药物-抗体复合物

7、(S-Ab)Bn随着S的加入，它对S*同Ab的结合则起竞争抑制作用，表现为使B*减少、使F*增加，并且只要S加入一定量，便有对应的F*和B*信号强度值，因此可建立S量(浓度)与响应值(F*和B*的信号强度)之间的函数关系，作成剂量反应曲线。免疫分析中各种竞争结合抑制曲线示意图3.3.标准曲线的绘制标准曲线的绘制与样品测定步骤与样品测定步骤1.取标准抗原，用无放射活性的空白血清或血浆稀释成58个系列浓度。2.加入定量标记抗原，其总放射性(T)应能满足准确测量的需要。3.加入定量的已稀释好的特异抗体，其抗体的量应满足灵敏度的要求。4.将标准抗原、标记抗原、特异抗体与缓冲液混匀后，在适当条件下温育，

8、待反应平衡后测定总计数率(T)。5.5.加入分离剂，加入分离剂，使结合部分使结合部分(B)(B)与游离部分与游离部分(F)(F)分离。分离。6.6.测定各管测定各管结合部分或游离部分的计数率结合部分或游离部分的计数率。7.7.标准曲线通常以标准抗原标准曲线通常以标准抗原(待测药物标准品待测药物标准品)的浓度的浓度为横坐标，以结合率为横坐标，以结合率(B(B)为纵坐标作图。为纵坐标作图。纵坐标纵坐标B B的计算：将与抗体结合的标记药物的的计算：将与抗体结合的标记药物的放射性强度放射性强度(B)(B)与加入的标记药物总放射性强度与加入的标记药物总放射性强度(T)(T)比较，即比较，即B B=(B=

9、(BT)T)100100；（二）酶免疫分析（二）酶免疫分析（enzyme immunoassay）标记物为酶标记物为酶，酶本身并不能直接产生信号，必须要有其他试剂如底物、辅酶等的参与才能完成酶反应，从而引起吸收光谱等的变化供测定。常用的酶为：常用的酶为：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、溶菌酶、-半乳糖苷酶。酶酶 底底 物物显色反应显色反应 测定波长测定波长 辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶 邻苯二胺邻苯二胺四甲替联苯胺四甲替联苯胺氨基水杨酸氨基水杨酸邻联苯甲胺邻联苯甲胺2,22,2-连胺基连胺基-2(3-2(3-乙基乙基-并噻并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 橘红色橘红

10、色黄色黄色棕色棕色兰色兰色蓝绿色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶 4-4-硝基酚磷酸盐硝基酚磷酸盐(PNP)(PNP)萘酚萘酚-AS-Mx-AS-Mx磷酸盐磷酸盐+重氮盐重氮盐 黄色黄色红色红色 400500 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪甲硫酚嗪+噻唑兰噻唑兰 黄色黄色深蓝色深蓝色 405420-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 甲基伞酮基半乳糖苷甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)(4MuG)硝基酚半乳糖苷硝基酚半乳糖苷(ONPG)(ONPG)荧光荧光黄色黄色 360,450420 1.均相酶免疫分析，均相酶免疫分

11、析，EMITEMIT法法（enzyme multipled immunoassay technique）基本原理：基本原理：酶标药物与未标记药物互相竞争有限量的抗体(Ab)，测定小分子抗原。酶标抗原(AgE)同抗体(Ab)结合后，所形成的酶标抗原一抗体结合物(AgEAb)可使酶的活性发生改变(增强或减弱)；可直接通过测定酶活性的变化，求出样品含量的方法。2.2.酶联吸附免疫分析酶联吸附免疫分析（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）n属于非均相免疫分析的代表，普遍应用于各领普遍应用于各领域。域。n基本原理：是将过量抗体（抗原）包被抗体（抗原）包被于载体

12、上，通过抗原抗体反应使酶标记抗体（抗原）酶标记抗体（抗原）也结合在载体上也结合在载体上，经洗涤洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后，加入底物显色显色，定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术。3种必要的试剂：固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（标记物）酶作用的底物（显色剂）1 1）双抗体夹心法）双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待检样品，再加酶标抗体，加底物显色应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定 如乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等获得待分析物的未标定抗体获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体载体连接形成固相抗体 洗

13、涤除去未结合的洗涤除去未结合的抗体及杂质抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物 洗涤除去其他洗涤除去其他未结合的物质未结合的物质 加酶标抗体生成加酶标抗体生成抗体抗体待测抗原待测抗原酶标记抗体酶标记抗体的复合物的复合物 彻底洗涤彻底洗涤未结合的未结合的 酶标抗体酶标抗体 加底物进行加底物进行酶催化反应酶催化反应 根据颜色反应的根据颜色反应的程度进行该抗原程度进行该抗原的定性或定量测定的定性或定量

14、测定2 2）间接法）间接法方法：利用酶标记的抗抗体以检测已与固相上抗原结合的受检抗体应用：常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定包被包被反应反应加入待测抗体或加入待测抗体或抗原和酶标抗原抗原和酶标抗原或抗体或抗体123 3）竞争法）竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）原（药物、激素等）ELISA试剂盒试剂盒（三）胶体金免疫快

15、速检测法（三）胶体金免疫快速检测法1.双抗体夹心法双抗体夹心法-大分子抗原大分子抗原 样本加到样本加到S S区，进入区，进入B B区和区和B B区的金标抗体发生免疫反应，再层析到区的金标抗体发生免疫反应，再层析到T T线位置时，如果样本中含有待测抗原，则线位置时，如果样本中含有待测抗原，则T T线不显色或显色很淡，线不显色或显色很淡，C C线显色，线显色，这样得到的是这样得到的是阳性阳性结果。当待测样本中不含抗原时，再层结果。当待测样本中不含抗原时，再层析到析到T T线位置时，则线位置时，则T T线显色，线显色，C C线也显色线也显色，得到，得到阴性阴性结果结果SBTCD2.2.竞争抑制法竞争

16、抑制法 （四）免疫印迹法（四）免疫印迹法第二节第二节 免疫预防免疫预防特异性免疫获得的方式：n自然免疫：主要指机体感染病原体后建立的特异性免疫，也包括胎儿和新生儿经胎盘或乳汁从母体获得的抗体。n人工免疫：人为的使机体获得特异性免疫，即免疫预防。n免疫预防(immunoprophylaxis)：根据特异性免疫原理，采用人工方法将抗原(疫苗、类毒素等)或抗体(免疫血清、丙种球蛋白等)制成各种制剂，接种于人体，使其获得特异性免疫能力，达到预防某些疾病。人工主动免疫人工主动免疫人工被动免疫人工被动免疫一、一、人工主动免疫（人工主动免疫（artificial active immunization）：）

17、：用疫苗接种机体，使之产生特异性免疫，从而预防感染的措施。（一）传统疫苗（一）传统疫苗1.死疫苗死疫苗：用物理或化学方法将病原微生物灭活而制成的制剂。n又称灭活疫苗。2.活疫苗活疫苗 用人工变异或直接从自然界筛选出来的毒力高度减弱、或由基本无毒的活病原微生物制成的制剂。n又称减毒活疫苗。3.类毒素类毒素：将细菌毒素用甲醛减毒后制备的具有免疫原性的物质。活疫苗与死疫苗的比较活疫苗与死疫苗的比较特点特点制剂特点制剂特点 接种剂量及次数接种剂量及次数恢复倾向恢复倾向无毒或减毒的活无毒或减毒的活微生物微生物量较小，一般仅需要量较小，一般仅需要一次一次 相对稳定性相对稳定性不稳定不稳定可以回复为毒株可以

18、回复为毒株强毒死微生物强毒死微生物量较大，需要多次量较大，需要多次接种接种较稳定较稳定不回复为毒株不回复为毒株免疫效果免疫效果较好，维持较好，维持3-53-5年甚至年甚至更长更长较差，维持半年至较差，维持半年至一年一年活疫苗活疫苗死疫苗死疫苗诱导的免疫类型诱导的免疫类型体液免疫和细胞体液免疫和细胞免疫免疫体液免疫为主体液免疫为主（二）新型疫苗 1.亚单位疫苗：去除病原体中与激发保护性免疫无关的甚至有害的成分，保留有效免疫原成分制作的疫苗。2.合成疫苗：根据有效免疫原性肽段的氨基酸序列合成的免疫原性多肽。3.重组抗原疫苗：利用DNA重组技术制备的只含保护性抗原的纯化疫苗。4.DNA疫苗：用编码病

19、原体有效免疫原基因的重组体直接接种，体内可表达保护性抗原，从而诱导机体产生特异性免疫。二、人工被动免疫（二、人工被动免疫（artificial passive immunization）：n给人注射含特异性抗体的免疫血清以治疗或紧急预防感染的措施。1、抗毒素、抗毒素：用细菌外毒素或类毒素免疫动物制备的血清，具有中和外毒素的作用。2、人免疫球蛋白制剂人免疫球蛋白制剂来源:恢复期病人供血者血浆，接种疫苗/类毒素的免疫者血浆。n计划免疫：计划免疫：根据某些特定传染病的疫情监测和人群免疫状况分析，按照规定的免疫程序有计划的进行人群预防接种。第三节免疫治疗第三节免疫治疗 免疫治疗免疫治疗（immunot

20、herapy）：利用免疫学原理，针对疾病的发生机制，人为的调整免疫功能，达到治疗目的所采取的措施。n免疫调节：免疫调节：即用物理、化学或生物学手段调节机体免疫功能。（免疫增强与免疫抑制）n免疫重建：免疫重建：将正常个体的造血干细胞或淋巴细胞转移给免疫缺陷个体，以恢复其免疫功能。1.治疗性疫苗：治疗性疫苗：指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱生特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化目的的产品。1890 年，Koch 用注射结核菌素和甘油悬液的方法来治疗结核病，开创了用疫苗治疗疾病的先例。1902 年，Wright 等就采用加热灭活的葡萄球菌治疗葡萄球菌性皮肤病。目前研究热点：针

21、对肿瘤、HIV、乙肝、自身免疫疾病的治疗性疫苗。n肿瘤疫苗是用肿瘤细胞、肿瘤细胞裂解物或肿瘤抗原激活机体免疫系统产生特异性抗肿瘤细胞免疫效应。n2010 年 4 月 29 日，FDA 批准了首个癌症治疗疫苗 Provenge 用于晚期前列腺癌的治疗。1.1.肿瘤细胞疫苗肿瘤细胞疫苗2.2.多肽疫苗多肽疫苗3.3.表达肿瘤抗原的重组病毒和表达肿瘤抗原的重组病毒和DNADNA疫苗疫苗:4.APC4.APC为基础的肿瘤疫苗或称为为基础的肿瘤疫苗或称为APCAPC疫苗疫苗1)肿瘤细胞疫苗肿瘤细胞疫苗传统的肿瘤细胞疫苗是通过照射灭活自体或同种异体肿瘤细胞或其粗提取物,抑制其增殖能力,保留其免疫原性.免疫

22、原性弱,难以引起免疫反应。与免疫佐剂如弗氏完全佐剂、卡介苗和短小棒状杆菌属等混合以增强其免疫原性.n肿瘤基因工程疫苗:n通过基因重组技术,将不同目的的基因如细胞因子、辅助刺激分子、MHC-I分子等导入肿瘤细胞而制备的疫苗。TUMOR CELLMHC-1 MHC-II()B7 蛋白酶体蛋白酶体(低分子多肽低分子多肽LMP)转运蛋白转运蛋白(TAP)基因转染基因转染CMV表达表达MHC-I等的等的DNA表达表达CTLMHC-ITUMOR CELL基因转染基因转染CMV表达细胞因子的表达细胞因子的DNA(IL-2,IL-4,INF-)表达表达lymphokin趋化趋化淋巴细胞趋化因子淋巴细胞趋化因子

23、主要包括肿瘤特异性抗原、病毒相关抗原、癌基因或抑癌基因突变蛋白的多肽组成的疫苗。DNADNA疫疫Plasmidvaccine由能引起保护性免疫反应的肿瘤抗原基因片段及其载体建构而成的。将编码细胞因子、细菌毒素、蛋白佐剂的DNA 与携带抗原基因的质粒DNA 融合更有效。4）树突状细胞疫苗）树突状细胞疫苗（1)细胞性肿瘤抗原修饰的DC 用肿瘤细胞裂解物冲击致敏 DC制备 DC疫苗（2)肿瘤抗原基因转染的DC疫苗 通过转基因的方法将编码肿瘤抗原基因转染给 DC,使其表达肿瘤抗原并对其加工,然后加佐剂回输到机体中诱导特异性抗肿瘤效应。（3)通过细胞融合制备DC疫苗 采用自体肿瘤细胞与DC进行融合制备杂

24、交瘤。2.2.抗原诱导耐受：抗原诱导耐受：口服耐受：口服耐受：是通过消化系统摄入外源性抗原诱导外周免疫系统产生抗原特异性无反应状态,但机体对其他抗原仍可产生正常的免疫性应答。n口服耐受治疗已进入临床实验阶段：类风湿关节炎鸡II型胶原蛋白 多发性硬化症牛磷脂治疗 葡萄膜炎牛视网膜S抗抗CD20的抗体治疗淋巴瘤的抗体治疗淋巴瘤HER-2单抗、名称名称 公司公司 适应症适应症 临床阶段临床阶段 可溶性可溶性 ILIL-1 1 受体受体 (干粉吸入剂干粉吸入剂)Immunex 哮喘 I/II 期 ILIL-1 1 受体拮抗剂受体拮抗剂 Amegen 败血性休克(试验中止),类风湿关节炎 III 期 可

25、溶性可溶性 ILIL-4 4 受体受体 Immunex 哮喘 I 期 可溶性可溶性 TNFTNF 受体受体 Immunex 类风湿关节炎 上市 TNFTNF 受体融合蛋白受体融合蛋白 Hoffmann-La Roch 休克,类风湿关节炎,多发性硬化症 II/III 期 DABDAB3 8 93 8 9-ILIL-2 2 (IL(IL-2 2 免疫毒素免疫毒素)Seragen T 细胞淋巴瘤,I 型糖尿病,严重类风湿关节炎,牛皮癣,HIV感染 上市 I/II 期 DABDAB3 8 93 8 9-EGFEGF Seragen 肿瘤 I/II 期 可溶性可溶性 VEGFVEGF 受体受体 (Flk

26、(Flk-1/KDR)1/KDR)Sugen 实体瘤和转移瘤 I 期 人源化抗人源化抗IL-8抗体抗体（ABX-IL8）Abgenix Severe psoriasis I/II 期 人 源 化 抗人 源 化 抗HER2(EGFR2)单抗单抗 Genentech 乳腺癌转移 上市 抗抗TNF 单抗单抗（infliximab）Centocor Crohns Disease 上市 四、细胞为基础的免疫治疗四、细胞为基础的免疫治疗n细胞疫苗细胞疫苗（肿瘤疫苗，树突装细胞疫苗）n造血干细胞移植造血干细胞移植（白血病，免疫缺陷症）免疫重建：免疫重建：将免疫功能正常个体的造血干细胞或淋巴干细胞，移植给免疫

27、缺陷个体，使后者的造血能力、免疫功能全部或部分得到恢复。n免疫效应细胞免疫效应细胞（细胞免疫缺陷症，抗肿瘤）免疫效应细胞免疫效应细胞五、免疫增强剂和免疫抑制剂五、免疫增强剂和免疫抑制剂免疫增强剂：免疫增强剂：n免疫因子：转移因子：增强免疫力；免疫核糖核酸：增强体液及细胞免疫；胸腺肽：增强免疫力；n化学合成药物：左旋咪唑；西咪替丁n左旋咪唑：刺激吞噬细胞的吞噬功能；促进T细胞产生IL2等细胞因子，增强NK细胞的活性等。n西咪替丁：组胺拮抗剂，可与组胺2受体结合，竞争性地抑制组胺的作用，可以阻止组胺对Ts细胞的活化作用，从而增强机体的兔疫功能。n微生物制剂卡介苗短小棒状杆菌n中药制剂香菇、灵芝等的真菌多糖成分药用植物及其有效成分 卡介苗：很强的非特异免疫刺激作用。卡介苗可活化巨噬细胞；促进IL1、IL2、1L4、TNF等多种细胞因子的产生；增强NK细胞和K细胞的活性。有效成分是其细胞壁胞壁酰二肽。短小棒状杆菌：活化巨噬细胞，促进IL1、IL2等细胞因子的产生。（二）免疫抑制剂 化学制剂 1、烷化剂：环磷酰胺 2、抗代谢药：硫唑嘌呤。激素：肾上腺皮质激素，抗炎。真菌代谢产物 1、环孢素A:抑制Th 2、FK-506(他克莫司)：大环内脂类药物,抑制IL-2。中药及其有效成分 雷公藤多甙 结结 语语