5人教版生物选修一 专题二微生物的培养与应用课题二土壤中分解尿素的细菌的分离和计数.ppt

1、 将将接种的培养基接种的培养基和和未接种的培养基未接种的培养基都放在都放在 37度恒温箱，培养度恒温箱，培养12h和和24h,观察并记录结观察并记录结 果。果。 三、结果分析与评价 四、课题延伸：菌种的保存 1.临时保藏： 接种到固体斜面培 养基，菌落长成后置 于4冰箱保存。 2.长期保存： 甘油管藏法 尿素分子的立体结构尿素分子的立体结构 1 1、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物 芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、 棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌 也能分解尿素。也能分解尿素。 2 2

2、、课题目的、课题目的 一、从土壤中分离出能够分解尿素的细菌一、从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 二、统计每克土壤样品中尿素细菌的数目二、统计每克土壤样品中尿素细菌的数目 启示：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。要求，到相应的环境中去寻找。 . 筛选菌株筛选菌株 PCR技术是一种常用的技术是一种常用的DNA扩增技术，此项技术扩增技术，此项技术 的自动化，需要使用耐高温的的自动化，需要使用耐高温的DNA聚合酶，如果聚合酶，如果 请你来找这种耐高温的酶，你会去哪里找？请你来找这种耐高温的酶，你会去哪里找？ 热泉热泉70-80摄氏度

3、的高摄氏度的高 温条件淘汰了绝大多数温条件淘汰了绝大多数 微生物，而耐热的微生物，而耐热的Taq 细菌脱颖而出。细菌脱颖而出。 水生耐高温细菌水生耐高温细菌Taq 1、实验室微生物的筛选原理（、实验室微生物的筛选原理（P21） 人为提供有利于目的菌株生长的条件（包人为提供有利于目的菌株生长的条件（包 括营养、温度、括营养、温度、pHpH等），同时抑制或阻止其他等），同时抑制或阻止其他 微生物生长。微生物生长。 （一一）筛选菌株筛选菌株 2 2、选择培养基、选择培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生在微生物学中，将允许特定种类的微生 物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生物生长，同时抑制或阻

4、止其他种类微生物生 长的培养基，称做长的培养基，称做选择培养基。选择培养基。 （一一）筛选菌株筛选菌株 加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基 细菌不生长，细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长酵母菌、霉菌等真菌能生长 不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基 分离分离自养型微生物自养型微生物 1.在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源 和氮源的分别是是什么物质？和氮源的分别是是什么物质？ 碳源是葡萄糖和尿素，氮源是尿素碳源是葡萄糖和尿素，氮源是尿素 2.分析该配方的培养基对微生物是否具有选择作分析该配方的培养基对微生物是否具有选择作 用？如果

5、有，又是如何进行选择的？用？如果有，又是如何进行选择的？ 有筛选作用。尿素是培养基中的唯一氮源，因此，有筛选作用。尿素是培养基中的唯一氮源，因此， 原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。 阅读阅读22页本课题使用的培养基配方页本课题使用的培养基配方 （二）统计菌落数目（二）统计菌落数目 显微镜直接计数法显微镜直接计数法 稀释涂布平板法（活菌计数法）稀释涂布平板法（活菌计数法） 1 1、显微镜直接计数法、显微镜直接计数法 1mm 每一个大方格边长为每一个大方格边长为 1mm ，则每一大方格的面积为，则每一大方格的面积为1mm2， 盖上盖玻片后，载玻片

6、与盖玻片之间的高度为盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所，所 以计数室的容积为以计数室的容积为0.1mm3。 1mm 下面以一个大方格有下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设个中方格的计数板为例进行计算：设 五个中方格中总菌数为五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为，菌液稀释倍数为B，那么，一个，那么，一个 大方格中的总菌数是多少大方格中的总菌数是多少? 1ml菌液中的总菌数菌液中的总菌数?(1ml=1cm3=1000mm3） 5AB104 5A 缺点：缺点： 不能区分死菌与活菌不能区分死菌与活菌 2、统计菌落数目统计菌落数目稀释涂布平板法稀释涂布平板法 平板

7、菌落数统计注意事项 1、几个菌落粘连一起，只要肉眼能区分，就算几个；、几个菌落粘连一起，只要肉眼能区分，就算几个； 2、不管菌落大小，只要肉眼看得见，就应该计数；、不管菌落大小，只要肉眼看得见，就应该计数； 【例例1 1】某同学在稀释倍数为某同学在稀释倍数为10106 6的培养基上的培养基上 测得平板上的菌落数的平均值为测得平板上的菌落数的平均值为234234，那么每，那么每 毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释毫升样品中菌落数是（涂布平板时所用稀释 液的体积为液的体积为0.1 mL0.1 mL） A.2.34A.2.3410108 8 B.2.34B.2.3410109 9 C.234C.

8、234 D.23.4D.23.4 思考思考1 1：如何根据平板上的菌落数推测：如何根据平板上的菌落数推测 出每出每mLmL样品中的菌株数？样品中的菌株数？ 【解析解析】选选B B。稀释倍数为。稀释倍数为10106 6，0.1 mL0.1 mL稀释液稀释液 的菌落数的平均值为的菌落数的平均值为234234，则每毫升样品中菌，则每毫升样品中菌 落数就为落数就为234/0.1234/0.110106 6= =2.342.3410109 9。 每每mL样品中的菌株数样品中的菌株数=（CV）M C C：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V V：涂布平板时所用的稀释液

9、的体积：涂布平板时所用的稀释液的体积 M M：稀释倍数：稀释倍数 思考思考2 2：为什么测平板上的菌落数可以：为什么测平板上的菌落数可以 推测样品中的活菌的数目？推测样品中的活菌的数目？ 当当样品的稀释度足够高样品的稀释度足够高时，培养基表面生时，培养基表面生 长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一 个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能 推测出样品中大约有多少活菌。推测出样品中大约有多少活菌。 为了保证结果准确，一般选用菌落为了保证结果准确，一般选用菌落 数在数在30300的平板进行计数。的平板进行计数。 思考思考3 3：统

10、计的菌落数往往比活菌的：统计的菌落数往往比活菌的 实际数目高还是低，为什么？实际数目高还是低，为什么？ 低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平低。因为当两个或多个细胞连在一起时，平 板上观察到的只是一个菌落。因此，板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结统计结 果一般用菌落数而不是活菌数来表示果一般用菌落数而不是活菌数来表示。 第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因 此结果不具有说服力。 第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板， 但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在 操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平 板的计数值用来求平均值。 实例分析实例分析1

11、 启 示 在设计实验时，一定要涂布至少3个平板 ，作为重复组，才能增强实验的说服力与 准确性。 在分析实验结果时，一定要考虑所设置的 重复组的结果是否一致，结果不一致，意 味着操作有误，需要重新实验。 实例分析实例分析2 想一想：想一想：A同学和其他同学所得实验结果差异同学和其他同学所得实验结果差异 如此之大，请分析原因可能有哪些？如此之大，请分析原因可能有哪些？ 实例分析实例分析2 想一想：你能通过设置对照，帮助想一想：你能通过设置对照，帮助A同学排除同学排除 上述两个可能影响实验结果的因素吗？上述两个可能影响实验结果的因素吗？ 一种方案：一种方案： 可以由其他同学用与可以由其他同学用与A同

12、学一样的土样进行实验。同学一样的土样进行实验。 如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；无误； 如果结果不同，则证明如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养同学存在操作失误或培养 基的配制有问题。基的配制有问题。 实例分析实例分析 想一想：你能通过设置对照，帮助想一想：你能通过设置对照，帮助A同学排除同学排除 上述两个可能影响实验结果的因素吗？上述两个可能影响实验结果的因素吗？ 另一种方案：另一种方案： 将将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行同学配制的培养基在不加土样的情况下进行 培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。培养，作为空白对照，以证明培养基是否

13、受到污染。 实验结果要有说服力，对照的设置实验结果要有说服力，对照的设置 是必不可少的！是必不可少的！ 实例启示实例启示 设置对照实验的目的是什么？ 排除实验操作、培养条件等无关变量对实验排除实验操作、培养条件等无关变量对实验 结果的影响，提高实验结果的可信度。结果的影响，提高实验结果的可信度。 实验设计实验设计 土壤中分解尿素的细菌的分离与记数土壤中分解尿素的细菌的分离与记数 1.土壤取样土壤取样 2.制备培养基制备培养基 3.样品稀释、取样涂布样品稀释、取样涂布 4.微生物的培养、观察并记录结果微生物的培养、观察并记录结果 5.细菌的计数细菌的计数 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分

14、解尿素的细菌的分离与计数 从肥沃、湿润的土壤中取样。先从肥沃、湿润的土壤中取样。先 铲去表层土铲去表层土3cm左右，再取样，将样左右，再取样，将样 品装入事先准备好的信封中。品装入事先准备好的信封中。 实验步骤实验步骤 1土壤取样土壤取样 制备制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和个牛肉膏蛋白胨培养基和 15个选择培养基，准备好个选择培养基，准备好无菌试管和无菌试管和 移液管移液管。 实验步骤实验步骤 2.制备培养基制备培养基 制备制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和个牛肉膏蛋白胨培养基和15个个 选择培养基，准备好选择培养基，准备好无菌试管和移液管无菌试管和移液管。 注：每个稀释度下需要注：每个稀释度下需要3

15、个选择培养基个选择培养基 （平行重复原则），（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养个牛肉膏蛋白胨培养 基。选用稀释倍数为基。选用稀释倍数为103107的稀释液。的稀释液。 实验步骤实验步骤 2.制备培养基制备培养基 为什么分离不同的微生物为什么分离不同的微生物 要采用不同的稀释度？测定土要采用不同的稀释度？测定土 壤中细菌的总量和测定土壤中壤中细菌的总量和测定土壤中 能分解尿素的细菌的数量，选能分解尿素的细菌的数量，选 用的稀释范围相同吗？用的稀释范围相同吗？ 因为因为土壤中各类微生物的数量土壤中各类微生物的数量(单单 位：株位：株/kg)是不同的是不同的，例如在干旱土壤，例如在干旱土壤 中的

16、上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌 数约为数约为2 185万，放线菌数约为万，放线菌数约为477万，万， 霉菌数约为霉菌数约为23.1万。因此，万。因此，为获得不同为获得不同 类型的微生物，就需要按不同的稀释度类型的微生物，就需要按不同的稀释度 进行分离进行分离，同时还应当有针对性地提供，同时还应当有针对性地提供 选择培养的条件。选择培养的条件。 测定土壤中细菌的数量，一般选测定土壤中细菌的数量，一般选 用用104、105和和106倍的稀释液进行平板倍的稀释液进行平板 培养；测定放线菌的数量，一般选用培养；测定放线菌的数量，一般选用 103、104和和105倍稀释

17、液；测定真菌的倍稀释液；测定真菌的 数量，一般选用数量，一般选用102、103和和104倍稀释倍稀释 液液。 注：注： 样品的稀释样品的稀释 将将10g土样加入盛有土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥无菌生理盐水的锥 形瓶中形瓶中,充分摇匀，吸取上清液充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛，转移至盛 有有9mL水的无菌试管中，依次等比稀释至水的无菌试管中，依次等比稀释至107稀稀 释度，并按照由释度，并按照由107至至103稀释度的顺序分别吸取稀释度的顺序分别吸取 0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的 顺序涂布平板，不必更换移液管。顺序涂布平板，不必

18、更换移液管。 实验步骤实验步骤 3.样品稀释、取样涂布样品稀释、取样涂布 注意：由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因注意：由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因 此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为10103 310107 7。 将涂布好的培养皿放在将涂布好的培养皿放在30下下 培养。比较牛肉膏培养基和选择培培养。比较牛肉膏培养基和选择培 养基中菌落的数量、形态等，并做养基中菌落的数量、形态等，并做 好记录。好记录。 4.微生物的培养、观察并记录结果微生物的培养、观察并记录结果 不同种类的微生物，往往需要不不同种类的微生物，往往需要不 同的培养温度

19、和培养时间。同的培养温度和培养时间。细菌细菌一般一般 在在3037的温度下培养的温度下培养12d；放线放线 菌菌一般在一般在2528的温度下培养的温度下培养57d； 而而霉菌霉菌一般在一般在2528的温度下培养的温度下培养 34d。 注：注： 一般来说，在一定的培养条件下一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养相同的培养 基、温度及培养时间基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的，同种微生物表现出稳定的 菌落特征。菌落菌落特征。菌落形状、大小、隆起程度和颜色形状、大小、隆起程度和颜色 当菌落数目稳定时，选取菌落数当菌落数目稳定时，选取菌落数 在在30300的平板进行计数。在同一稀的平板进行

20、计数。在同一稀 释度下，至少对释度下，至少对3个平板进行重复计数，个平板进行重复计数， 然后求出平均值，并根据平板所对应然后求出平均值，并根据平板所对应 的稀释度计算出样品中细菌的数目。的稀释度计算出样品中细菌的数目。 实验步骤实验步骤 5.细菌的计数细菌的计数 一一无菌操作无菌操作 1 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都 需要灭菌需要灭菌。 2 2、应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的在火焰附近将称好的 土样倒入锥形瓶中土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞塞好棉塞。 3 3、在稀释土壤溶液的过程中在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火每

21、一步都要在火 焰旁操作焰旁操作。 二二做好标记做好标记 注明培养基种类注明培养基种类、培养日期培养日期、平板培养样品的平板培养样品的 稀释度等稀释度等。 三三规划时间规划时间 挑选选择培养基中不同形态的菌落挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基接入含酚红培养基 的斜面中的斜面中，观察能否变红。，观察能否变红。 1 1、结合对照结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以分析培养物中是否有杂菌污染以 及选择培养基是否筛选出一些菌落及选择培养基是否筛选出一些菌落。 2 2、是否获得了某一稀释度下是否获得了某一稀释度下，菌落数目在菌落数目在3030 300300的平板的平板。在这稀释度下在这稀释度

22、下，是否至少有两个是否至少有两个 平板的菌落数相近平板的菌落数相近？ 3 3、你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌 的菌落数是多少的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗与其他同学的结果接近吗？ 如果差异很大如果差异很大，可能是什么原因引起的可能是什么原因引起的？ 滤膜法滤膜法 以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。将已知以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例。将已知 体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养液基上体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养液基上 培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。 可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中 大肠杆菌的数量。大肠杆菌的数量。 微生物计数微生物计数 作业： 1.阅读课本p21-p26 2.完成本节创新设计大书