免疫沉淀实验课件.pptx

1、实验一实验一免疫沉淀类反应免疫沉淀类反应l免疫沉淀反应：免疫沉淀反应：可溶性可溶性抗原与相应抗体在抗原与相应抗体在溶液或凝胶中接触形成肉眼可见的抗原抗溶液或凝胶中接触形成肉眼可见的抗原抗体复合物沉淀称为免疫沉淀反应。体复合物沉淀称为免疫沉淀反应。沉沉淀淀反反应应环状沉淀反应环状沉淀反应絮状沉淀反应絮状沉淀反应琼脂扩散试验琼脂扩散试验单向扩散试验单向扩散试验电电泳泳技技术术火箭免疫电泳火箭免疫电泳对流免疫电泳对流免疫电泳双向扩散试验双向扩散试验一、双向免疫扩散试验一、双向免疫扩散试验l 指指可溶性抗原可溶性抗原与相应抗体在与相应抗体在琼脂琼脂介质中相互扩散，介质中相互扩散，彼此相遇，在浓度比例适

2、当处形成彼此相遇，在浓度比例适当处形成沉淀线沉淀线。l 根据沉淀线的有无、形状和位置对抗原或抗体进根据沉淀线的有无、形状和位置对抗原或抗体进行行定性定性分析，也可用于抗体的分析，也可用于抗体的半定量半定量检测检测l 本次实验利用此原理进行本次实验利用此原理进行抗体效价抗体效价的测定的测定实验原理实验原理ABC试剂与器材试剂与器材l 抗体：兔抗人全血清抗体：兔抗人全血清 l 抗原：人血清抗原：人血清l 10-15g/L 10-15g/L 琼脂（以生理盐水配制）琼脂（以生理盐水配制）l 载玻片、打孔器、微量进样器载玻片、打孔器、微量进样器l 37 37水浴箱水浴箱l制板制板 取加热融化的盐水琼脂约

3、取加热融化的盐水琼脂约4ml4ml，均匀浇在水，均匀浇在水平放置的载玻片上，使成厚度约为平放置的载玻片上，使成厚度约为1.5mm1.5mm的琼脂的琼脂板，待冷凝。板，待冷凝。l打孔打孔 打梅花孔（如图），各孔间的距离为打梅花孔（如图），各孔间的距离为4-5mm4-5mm。实验步骤实验步骤1l倍比稀释抗体倍比稀释抗体 （见下表）（见下表）l加样加样 用微量加样器分别取抗原、抗体用微量加样器分别取抗原、抗体10ul10ul加入加入各孔。中央孔加各孔。中央孔加10ul10ul抗原，周围抗原，周围6 6孔分别加不同孔分别加不同稀释度的抗体。稀释度的抗体。l温育温育 将玻片放在湿盒中，将玻片放在湿盒中，

4、3737温育温育24h24h，观察沉，观察沉淀线。淀线。123456生理盐水生理盐水2525252525抗人血清抗人血清502525252525l在抗原和抗体孔之间会看到白色的沉淀线，在抗原和抗体孔之间会看到白色的沉淀线，将出现白色沉淀线的抗体最高稀释孔作为将出现白色沉淀线的抗体最高稀释孔作为该抗体的该抗体的效价效价。结果判断结果判断应用应用l 检测未知抗原或抗体检测未知抗原或抗体l 抗原性质分析抗原性质分析 l 抗体效价滴定抗体效价滴定l 抗原或抗体纯度鉴定抗原或抗体纯度鉴定l玻片要清洁，边缘无破损。玻片要清洁，边缘无破损。l浇制琼脂板时要均匀、无气泡。浇制琼脂板时要均匀、无气泡。l孔要打得

5、圆整光滑，边缘不要破裂，底部勿与载孔要打得圆整光滑，边缘不要破裂，底部勿与载玻片脱离。玻片脱离。l加样时应尽量避免气泡或加到孔外，以保证结果加样时应尽量避免气泡或加到孔外，以保证结果的准确性。的准确性。l反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导 致假阴性、不出现或不清楚。致假阴性、不出现或不清楚。注意事项注意事项l对流免疫电泳是将对流免疫电泳是将双向免疫扩散双向免疫扩散和和电泳电泳相结相结合的一种技术。合的一种技术。l在在pH8.6的缓冲液中，的缓冲液中，抗原抗原带负电荷，向带负电荷，向正正极移动；极移动；抗体抗体在电渗作用下向在电渗作用下向负负极移

6、动。在极移动。在两者相遇的最适比例处形成白色沉淀线。两者相遇的最适比例处形成白色沉淀线。实验原理实验原理二、对流免疫电泳二、对流免疫电泳l抗原：人全血清抗原：人全血清l抗体：兔抗人全血清抗体：兔抗人全血清l1 1琼脂：琼脂：0.05mol/L pH8.60.05mol/L pH8.6的巴比妥缓冲液的巴比妥缓冲液配制配制l电泳槽、电泳仪、电泳槽、电泳仪、l载玻片、水浴箱、打孔器、微量加样器载玻片、水浴箱、打孔器、微量加样器试剂和器材试剂和器材l制板制板 取已经融化的取已经融化的1%1%琼脂约琼脂约4ml4ml，加到，加到水平放置的载玻片上，使成厚度约为水平放置的载玻片上，使成厚度约为1.5mm1

7、.5mm的琼脂板，待冷凝。的琼脂板，待冷凝。l打孔打孔 用打孔器打孔，孔径用打孔器打孔，孔径3mm3mm，两孔间，两孔间隔隔4-5mm4-5mm。（如下图所示）。（如下图所示）实验步骤实验步骤l加样加样 用微量加样器分别取用微量加样器分别取10vl10vl抗原、抗体，抗原、抗体，按图加样。按图加样。+AgAb人血清人血清羊抗人血清羊抗人血清生理盐水生理盐水l 电泳电泳 将琼脂板置于电泳槽内（将琼脂板置于电泳槽内（抗原抗原端放端放阴阴极侧，极侧，抗体抗体端放端放阳阳极侧），两端贴上用电泳极侧），两端贴上用电泳液浸湿的纱布。通电，调整电压为液浸湿的纱布。通电，调整电压为4V/cm4V/cm长或长或

8、电流电流3-4mA/cm3-4mA/cm宽，电泳宽，电泳30min-1h30min-1h。结果判断结果判断l在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在对孔之间是否有白色沉淀线出现。在对孔之间是否有白色沉淀线出现。l如果沉淀线不清晰，可将琼脂板放入湿盒如果沉淀线不清晰，可将琼脂板放入湿盒于于3737保温数小时，可增强沉淀线的清晰保温数小时，可增强沉淀线的清晰度。度。注意事项注意事项l加样时不要起气泡，勿溢出琼脂孔。加样时不要起气泡，勿溢出琼脂孔。l抗原、抗体的量应相近，如抗原量过多，抗原、抗体的量应相近，如抗原量过多，可造成假阴性结果，须通过稀释抗原加以可造成假阴性结果，须通过稀释抗原加以解决。解决。l电泳时电压不宜过高或过低，过高可能会电泳时电压不宜过高或过低，过高可能会将琼脂拉断；过低时沉淀线出现的时间会将琼脂拉断；过低时沉淀线出现的时间会延长。延长。结束语当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的，所以不要放弃，坚持就是正确的。When You Do Your Best,Failure Is Great,So DonT Give Up,Stick To The End谢谢大家荣幸这一路，与你同行ItS An Honor To Walk With You All The Way演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日