基因甲基化给研究生讲课课件.ppt

1、.表观遗传学表观遗传学u从根本上讲，表观遗传是环境因素和细胞内的遗传物质之间发生交互作用的结果。u与中心法则不同，表观遗传学认为遗传信息并非单方向传递，环境因素也能改变遗传物质。u目前表观遗传学研究主要集中在甲基化、组蛋白修饰、小RNA 和 染色质重塑等方面。.骡和駃騠前者又称马骡，是公驴与母马杂交的后代，体大、耳小而尾部蓬松;后者又叫驴骡，是公马与母驴杂交的后代，相对来说体小、耳大而尾毛较少。这个现象表明，来源于不同性别亲本的遗传物质在后代表达的功能可以有差别。这就是基因印记。基因印记基因印记 Hinny 駃騠駃騠Mule.u类胰岛素生长因子-2 基因Igf2(位于7 号染色体)在小鼠身体里

2、是否表达，要看它是否是受之于父亲，因为来自母亲的基因拷贝是处于失活性状态的。这就是说，该基因是被母亲所印记的。u相反，17 号染色体上的Igf2r是被父亲所印记的，被特别关注。因为来自父亲的Igf2r是处于失活性状态的，它只有受之于母亲才在体内表达。类胰岛素生长因子类胰岛素生长因子.u亲代印记的结果是，被印记的基因所表现的形式好像半合子的情况，尽管在每一个细胞中这种体细胞基因均成对存在。u分子水平的分析发现，DNA 序列并没有发生改变。那么，功能与性状的变化因何而起?.X染色体失活染色体失活X 连锁的O基因控制黄色毛性状，其等位基因o控制黑色毛性状，另有常染色体基因S 控制白色性状。在杂合子猫

3、XOXo，一些细胞团产生黄毛、一些细胞团产生黑毛，在白色背景下构成3 色皮毛。.现象与猜想现象与猜想基因一定受到了某种修饰，这种修饰效基因一定受到了某种修饰，这种修饰效应能够通过有丝分裂和减数分裂实现代应能够通过有丝分裂和减数分裂实现代间传递。间传递。甲基化的发现甲基化的发现 1979 年年 Mc Ghee 等发现与鸡等发现与鸡珠蛋白珠蛋白基因比邻的胞嘧啶核苷酸甲基化后，该基因比邻的胞嘧啶核苷酸甲基化后，该基因转录受抑制的现象。基因转录受抑制的现象。.胞嘧啶的胞嘧啶的嘧啶环上嘧啶环上第第5 5位碳原子位碳原子加上一个甲基加上一个甲基.DNA 甲基化的可遗传特性是通过agouti viable

4、yellow(Avy)小鼠模型研究发现的。Avy 小鼠毛色控制基因agouti 的第一外显子前插入了一段逆转座子(IAP)序列。agouti 基因的表达间接地受到IAP 的启动子调控，因而IAP 启动子的甲基化状态可以通过小鼠的毛色鉴定出来。通过给孕期的母鼠补充富含甲基的食物可以改变后代中三种毛色小鼠的比例，IAP 启动子被甲基化的小鼠，即棕色小鼠的比例增加了。.IPALTRLTRPhenotype diversity contributed by dynamics of epigenotypeWTIPALTRLTRAgouti.别小看一个小小的修饰，却给DNA增加了额外的信息，使得有限的基因

5、组遗传信息的表现呈现出丰富的多样性和可塑性。.简单地把DNA甲基化理解为“一把锁”，凡是被DNA甲基化标记的部分，大都是需要被“尘封”“监禁”的基因，比如基因组的“捣蛋鬼”转座子，就是被甲基化这把“锁”管制着，失去管制或管制不严，这些“捣蛋鬼”会在基因组里跳来跳去，把基因组搞得一团糟，会引起很多问题，如肿瘤、精神疾病等。.酵母与果蝇基因组中未能检测到任何甲基化CpG，这两种生物并不依赖DNA甲基化的方式来控制基因活性，它们采用其它的机制来达到同一目的。脊椎动物与高等植物普遍利用DNA甲基化作为重要的调控机制。.lDNA甲基化是常见的表观遗传学现象，它是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的作用下

6、，将甲基添加在DNA分子中的碱基上。lDNA甲基化的主要形式:5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。哺乳动物基因组中约有5一1O 是CpG位点，其中约有70 为mCpG。.CpG岛岛uCpG岛主要位于基因的启动子区，少量位于基因的第一个外显子区；其甲基化状态直接影响基因表达。u甲基化的 CpG 双核苷酸通过募集转录抑制因子或者阻碍转录激活因子的结合抑制基因的表达抑制基因的表达。uCpG岛一般是非甲基化的，而在失活 X染色体、印记基因和非表达的组织特异基因中则是甲基化的。u成体基因组通常中，奢侈基因呈现高密度甲基化，而含有丰富 CpG 岛的管家基因则呈非甲基化。.CpG CpGCpG

7、表示核苷酸对，其中G在DNA链中紧随C后。基因组中60%90%的CpG 都被甲基化,未甲基化的CpG 成簇地组成CpG 岛,位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。.基因组甲基化的特点：可逆性许多甲基化位点可以根据细胞活性的要求重新甲基化或去甲基化；组织特异性不同的组织细胞具有不同的甲基化模式，为基因表达设定程序。异常的甲基化可分为高甲基化和低甲基化，前者指正常组织中不发生甲基化的位点被甲基化，后者是指在正常组织中发生甲基化的位点去甲基化。.突变热点：5-mCw胞嘧啶发生脱氨基作用,就可能被氧化成为U,被DNA修复系统所识别和切除,恢复成C.已经甲基化的胞嘧啶发生脱氨基作用,它就变为T,无法

8、被区分.w可能导致基因置换突变,发生碱基错配:T-G,如果在细胞分裂过程中不被纠正,就会诱发遗传病或癌症。.DNA甲基化的相关蛋白从头甲基化酶Dnmt3a 在未分化的胚胎干细胞中高度表达，在体细胞中表达水平很低。主要作用是从头甲基化，负责重复序列的甲基化。Dnmt3b维持DNA甲基化转移酶Dnmt1MET1 与繁殖细胞核酸抗原(PCNA)、组蛋白脱乙酰酶2(HDAC2)和一个新的蛋白质DNAP1(DNMT1相关蛋白)组成复合体，维持CG序列的甲基化。CMT 仅发现在植物中，其催化区l和包埋染色体的主区，并且特异性地维持CG序列的甲基化。去甲基化酶5一甲基胞嘧啶糖基化酶、MBD25一甲基胞嘧啶糖

9、基化酶是体内候选去甲基化酶。.DNA 甲基化的机制1)DNM T1,持续性DNA 甲基转移酶使仅有一条链甲基化的DNA 双链完全甲基化；参与DNA 复制双链中的新合成链的甲基化；DNM T1 可能直接与HDAC(组蛋白去乙酰基转移酶)联合作用阻断转录。2)DNM T3a、DNM T3b从头甲基转移酶它们可甲基化CpG,使其半甲基化,继而全甲基化；可能参与细胞生长分化调控,其中DNM T3b在肿瘤基因甲基化中起重要作用。.DNA甲基化的机制DNA甲基化反应分为2种类型：一、从头甲基化：2条链均未甲基化的DNA被 甲基化。二、保留甲基化：双链DNA的其中1条链已存在甲基化，另1条未甲基化的链被甲基

10、化。.DNA 去甲基化w1)被动途径:由于核因子N F 粘附甲基化的DNA,使粘附点附近的DNA不能被完全甲基化,从而阻断DNM T1 的作用。w2)主动途径:是由去甲基酶的作用,将甲基基团移去的过程。.甲基化酶甲基化酶u一般按甲基化的方式将甲基化酶（DNA methytransferase，DNMT）分为2类：u一种是维持型甲基转移酶，需以半甲基化的双链 DNA 为模板，指导新合成的链甲基化；u一种是全新甲基化酶，不依赖半甲基化 DNA 分子中的甲基化模板而从新开始合成5mC.u哺乳动物细胞中已知有活性的 DNMT 有 3 种，它们是 DNMT1、DNMT3a、DNMT3b。uDNMT1 的

11、主要功能是作为 DNA 复制复合物(DNA synthesome)中的组分，催化子链 DNA 半甲基化位点甲基化，维持复制过程中甲基化位点的遗传稳定性；uDNMT3a 和 DNMT3b 主要催化从头甲基化，以非甲基化的 DNA 为模板，催化新的甲基化位点形成，在胚胎发育中起重要作用。甲基化酶甲基化酶.CpG岛的形成岛的形成虽然人类基因组上有的 CpG 岛处于甲基化状态，但是大部分 CpG 岛是不易被甲基化的，这同基因组上约 80%的 CpG 双核苷酸处于甲基化状态的现象形成鲜明对比。该现象促使人们思考为什么CpG 岛不易被甲基化。.去甲基化酶去甲基化酶哺乳动物体内可能可能存在去甲基化的酶，这种

12、酶可能可能为一种糖基化酶、核酸内切酶或真正的去甲基化酶。近2年来，对去甲基化酶的研究有所突破。一般认为，DNA 甲基化有两种方式：一种是主动去甲基化；另一种是复制相关的 DNA 去甲基化.DNA甲基化与肿瘤w肿瘤细胞的特征：癌基因低甲基化 被激活；抑癌基因高甲基化 被沉默 肿瘤中普遍存在DNA甲基化状态的改变，其特点是总体的甲基化水平降低与局部的甲基化水平升高。w 低甲基化可诱导原癌基因和转座子成分活化，基因印迹缺失以及染色体不稳定性增加，最终诱发肿瘤w 在整体低甲基化的水平下，某些抑癌基因发生高甲基化，导致基因沉默，对肿瘤抑制能力低下w甲基化水平与肿瘤生物学特性密切相关，甲基化水平与肿瘤生物

13、学特性密切相关，DNA甲基化水平越低，染甲基化水平越低，染色体越容易发生功能异常，肿瘤的浸润能力就越高，临床分期也愈色体越容易发生功能异常，肿瘤的浸润能力就越高，临床分期也愈晚晚.肿瘤的去甲基化治疗 DNA甲基化程度依赖于DNMT活性。正常甲基化模式的建立需要DNMT1和DNMT3的共同作用，DNMT1是DNMT3启动CpG核苷酸从头甲基化的保证，而DNMT3则使甲基化水平稳定在正常需要水平（去甲基化）抑制DNMT活性药物是治疗肿瘤的新希望 胞苷类似物通过共价键与DNMT形成不可逆的复合物从而竞争性抑制其活性,使DNA甲基化随细胞分裂进行性丢失,部分地逆转肿瘤的恶性表型。中国测序论坛.甲基化的

14、检测方法甲基化的检测方法.高效液相色谱法w组织DNA提取(酚-氯仿法)wDNA的水解w 取相当于50微克DNA的溶液用40%的氢氟酸溶解,调整DNA浓度为1g/L。100C水浴3 h使DNA水解完全。氮气吹干备用。上样前将处理好的DNA样品加入200 微升新鲜配制的0.05 moL/L磷酸二氢钾溶液溶解。.w胞嘧啶3.36 min;5-甲基胞嘧啶4.33 min;腺嘌呤7.06min;鸟嘌呤8.43 min;胸腺嘧啶13.98 min.一、甲基化分型 绝大多数的DNA 甲基化分型均基于聚合酶链反应(PCR)的方法,使用亚硫酸氢钠处理过的DNA 作为模板。PCR 引物设计上通常存在2 种策略:甲

15、基化非依赖性PCR(methy lationindependent PCR,M IP)引物:甲基化特异性PCR(m ethylat ion specific PCR,MSP)引物。.（1）甲基化特异性甲基化特异性PCR(m ethylat ion2specif ic PCR,M S PCR)该法是检测基因组DNA 甲基化水平的一种常用方法,原理是DNA 经亚硫酸氢钠处理后,非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。在PCR 反应时,有两套不同的引物对:其一引物序列来自经处理后的甲基化DNA 链,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点发生了甲基化;另一引物来自经处理后的非甲基化D

16、NA 链,若用该对引物能扩增出片段,说明该检测位点没有甲基化。两对引物都具有很高的特异性,与未经处理的DNA 序列无互补配对。.M S PCR 是一种快速检测方法,只需极少量的DNA 用于分析。不足之处在于:引物的选择和设计非常关键,否则易导致假阳性;如果亚硫酸氢钠对DNA 处理不完全,也易导致假阳性;M SP 法是以引物中所有CpG 位点胞嘧啶均甲基化为前提设计的,而事实上甲基化的CpG 岛中却并非每个CpG 位点都完全甲基化,所以,M SP 法常常存在目标片段难扩增,或者特异性差等问题,不能反映整个CpG 岛甲基化状态的缺陷。.w中国科学院化学研究所与清华大学的研究人员合作,发展了基于水溶性阳离子型共轭聚合物的新DNA 甲基化分析方法.通过荧光共振能量转移技术(FRET)研究了质粒和人肿瘤细胞p16 基因启动子区特异CpG 位点的甲基化状态(原理见图1).该技术具有较高的灵敏度和特异性,引物无需荧光标记,检测在均相溶液中进行,无需分离、纯化手段,而且与高通量分析兼容,在癌症临床诊断上具有潜在的应用价值。w共轭聚合物具有强的光捕获能力,具有倍增光学响应性,可用来放大荧光传感信号,为生物传感器的发展提供了新的传感模式.