DNA重组与克隆总结课件.ppt

1、 发生在DNA分子内或分子间的遗传信息重新组合，称为遗传重组遗传重组(recombination)或基因重排，重组产物称为重组体DNA(recombinant DNA)。真核生物基因重组的主要途径，是减数分裂时同源染色体之间的交换。细菌的基因组为单倍体，虽然不进行减数分裂，也可通过多种形式进行遗传重组，如质粒DNA插入宿主的染色体均是典型的同源重组。DNA重组对生物进化，物种多样性和种群内的遗传多样性起着关键的作用。基因突变:有利突变，有害突变 生物如何积累有利突变，淘汰有害突变？DNA重组能迅速增加群体的遗传多样性(diversity)，通过优化组合(optimization)积累有利突变，

2、推动生物进化。用人工操作构建DNA重组体，将其导入受体细胞扩增或表达，称DNA克隆或分子克隆分子克隆(molecular cloning)，也可称作重组DNA技术，或基因工程。基因工程技术制造生物制品。定向改变生物的遗传特性，使生物体获得某些优良性状。转基因食品安全?基因治疗,安全性?6.1 同源重组同源重组 同源重组同源重组(homologous recombination)发生在同源DNA片段之间，是在两个DNA分子的同源序列之间直接进行交换的一种重组形式。不同来源或不同位点的DNA，只要二者之间存在同源区段，都可以进行同源重组。由于其广泛存在，亦称一般性重组(general recomb

3、ination)。细菌的接合(conjugation)、转化(transformation)和转导（transduction)，以及真核细胞减数分裂时同源染色体之间发生的交换等都属于同源重组。6.1.1 同源重组的分子模型同源重组的分子模型6.1.1.1 Holliday模型模型 Holliday模型模型由美国科学家Holliday于1964年提出。(1)切割 2条同源DNA各有1条链在相同的位置被特异性的内切酶切开。(2)交叉和连接 被切开的链交叉，并与另一个分子的同源链连接，分子弯曲形成Holliday连接。(3)拆分，产生重组体 补丁重组体(patch recombinant heter

4、oduplex)。拼接重组体(splice recombinant heteroduplex)(1)切割 2条同源DNA各有1条链在相同的位置被特异性的内切酶切开。(2)交叉和连接 被切开的链交叉，并与另一个分子的同源链连接，分子弯曲形成Holliday连接。(3)拆分 水平方向的切割(WE裂解)，由此产生的重组体制交换了DNA的一个小片段，称补丁重组体(patch recombinant heteroduplex)。垂直方向的切割(NS裂解)，由此产生的重组体有一条链由两个DNA分子的链拼接而成，称拼接重组体(splice recombinant heteroduplex)。Holiday中

5、间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC)DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶片段重组体片段重组体拼接重组体拼接重组体目目 录录Potter和Dressler在电镜下看到的Holliday中间体的结构(图6-2)，是对Holliday模型强有力的支持。尽管Holliday模型能解释重组的许多特征，但也有某些不足。其一，DNA重组时，通常有一个分子是供体，另一个是受体，而Holliday模

6、型无法区分供体和受体。其二，Holliday模型需要两个DNA分子各有一条链在同一位置被切割，目前尚未发现完成这一过程的确切机制。6.1.1.2 单链断裂模型单链断裂模型(the single-stranded break model)，单链断裂模型认为，在同源区时，只有供体分子产生一个单链切口，形成DNA单链，并入侵受体DNA分子，形成Holliday结构。其后进行的交叉点移动，和Holliday结构的拆分，与Holliday模型相同。单链断裂模型能很好的解释细菌的接合作用和转化等原核生物的同源重组，以及DNA损伤的重组修复。6.1.1.3 双链断裂模型双链断裂模型 双链断裂模型双链断裂模型

7、(the double-stranded break model,DSB)认为，受体双链(recipient duplex)两条链的断裂启动了链的交换，不产生断裂的被称为供体双链(donor duplex)。随后发生的DNA修复合成以及切口连接导致形成两个Holliday连接。DNA受到的双链断裂损伤，可以通过同源重组来修复，在修复损伤的同时，进行基因重组。真核生物的细胞减数分裂时的同源重组，符合双链断裂模型。(1)内切酶切开受体双链DNA分子同源区的两条链，启动重组过程(图6-3a)。(2)在外切酶的作用下，双链切口扩大，产生两个具有3-末端的单链区，并形成一个缺口(图6-3b)。(3)一个

8、自由的3-端入侵供体双链DNA分子的同源区，形成异源双链，供体双链的一条链被取代，产生取代环(a displacement loop,D环,图6-3c)。(4)人侵的3-端引发以被人侵DNA链为模板的DNA合成，导致D环扩大。以D环的单链为模板，填补受体链上的缺口(图6-3d)。(5)DNA连接酶连接切口，形成两个Holliday连接，即联结体x和联结体y(图6-3e)。(6)Holliday连接的拆分有4种可能。6.1.2 细菌的基因转移与重组细菌的基因转移与重组6.1.2.1 细菌的接合作用细菌的接合作用(conjugation)细菌的细胞相互接触时，遗传信息可在接合质粒的参与下，由一个细

9、胞转移到另一细胞，称为接合作用接合作用。能够促使染色体基因转移的接合质粒称为致育因子(fertility factor)，简称性因子或F因子。F+菌株，F因子独立存在.Hfr菌株：F因子插入到染色体DNA上。F-菌株，不含F因子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收。F因子通过结合作用由F+细胞向F细胞转移的电镜照片。F+细胞的性菌毛与F-细胞结合后收缩，使二者靠近，TraD蛋白构成转移的通道，在TraI在TraY的帮助下结合到转移起点oriT上，切开一条链，使其5端进入受体细胞，并合成其互补链，使F细胞转化为F+细胞，给体细胞中的单链也可以合成互补链。6.1.2.2 细菌的遗传转化细菌的遗传转

10、化(genetic transformation)遗传转化遗传转化指细菌吸收外源DNA(转化因子)而发生遗传性状改变的现象。能摄取DNA分子的细菌称为感受态细胞感受态细胞(competent cell)。自然转化是细菌遗传信息转移和重组的一种重要方式，但多数细菌在自然条件下不发生转化，或转化效率很低。在科研工作中，通常用高浓度Ca2+诱导细胞成为感受态，提高转化率。细菌的遗传转化细菌的遗传转化例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。6.1.2.3 细菌的转导细菌的转导(transduction)转导转导是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程。

11、当病毒从被感染的细胞（供体）释放出来，再次感染另一细胞（受体）时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。溶溶 菌菌感感 染染重重 组组感感 染染细细 菌菌噬菌噬菌体体转导：通过病毒介导发生在供体细胞与受体细胞转导：通过病毒介导发生在供体细胞与受体细胞 之间的之间的DNA转移及基因重组转移及基因重组6.1.2.4 细菌的细胞融合细菌的细胞融合用溶菌酶除去两个菌株的细胞壁，使之成为原生质体。然后，人工促进原生质体的融合，这便是细菌的细胞融合(cell fusion)。细胞融合后，两个菌株的DNA发生广泛的基因转移和重组。6.1.3 细菌同源重组的酶学机制细菌同源重组的酶学机制（1）（

12、Chi）位点和位点和RecBCD(外切核酸酶外切核酸酶)的作的作用用位点是RecBCD作用的调控位点.RecBCD是一种多功能酶，具有3种酶活性：依赖于ATP的外切核酸酶活性；可被ATP增强的内切核酸酶活性；ATP依赖的解旋酶活性。当DNA分子断裂时，它即结合在其游离端，使DNA双链解旋并降解。RecA蛋白的带状图解 RecA蛋白RecA蛋白与单链DNA结合形成每圈含6个单体的螺旋纤丝(helical filament)。促进同源重组过程中DNA单链的入侵。RecA可以与双链DNA作用，在此过程中，由RecA水解ATP提供反应所需能量。首先，RecBCD结合到DNA的末端，并使DNA解旋。接着

13、SSB和少量的RecA结合到单链区，RecBCD从末端起切割单链，3-端比5-端快。当酶切位点移动到位点附件时，3-端的水解停止，5-端的水解速度加快，产生具有3-端的游离单链。在此过程中，RecA取代SSB与游离单链结合。RecA的作用分为3个阶段：在前联会(presynapsis)阶段，RecA分子通过其第一DNA结合位点与单链DNA结合。在联会前(synapsis)阶段，RecA分子通过其第二DNA结合位点与另一个DNA双螺旋结合，形成三链DNA中间体，随后，单链DNA入侵双链DNA，并快速扫描搜索同源区。在链交换阶段，入侵的单链DNA置换双螺旋的一条链，产生杂合DNA双螺旋(图6-6)

14、。Holliday中间体已经形成。（2）RecA蛋白引起蛋白引起DNA同源重组同源重组RecA蛋白引起DNA同源重组的模型（3）Ruv蛋白和蛋白和Holliday联结体的拆分联结体的拆分Holliday中间体移动时，需要两个DNA分子进行旋转。RuvA和RuvB蛋白在推动DNA分子旋转中起关键作用。Ruv A蛋白能够识别Holliday联结体的交叉点，还可帮助RuvB结合在双链DNA上。RuvB是一种解螺旋酶。通过水解ATP而推动交叉点的移动。Holliday联结体最后由RuvC拆分，并由DNA聚合酶和DNA连接酶进行修复合成。(图6-7)。假设的RuvA四聚体与Holliday位点结合的结构

15、模型。6.1.4 真核生物的同源重组真核生物的同源重组6.1.4.1 减数分裂中的同源重组减数分裂中的同源重组真核生物的同源重组主要发生在细胞减数分裂前期I两个配对的同源染色体之间(非姊妹染色单体)，先在细线期(leptotene)和合线期(zygotene)形成联会复合体(synaptonemal complex,SC)，再在粗线期(pachytene)进行交换。(1)Spol1蛋白切割DNA双链。(2)MRX酶复合物催化的5 3切除。MRX酶复合物与细菌的RecBCD没有同源性，但在同源重组中所起的作用与RecBCD相似。(3)Rad51和Dmc1与单链DNA结合，Rad51和Dmc1的作

16、用与细菌的RecA蛋白相似，二者均可形成丝状聚集体，并与单链DNA结合，促进非姐妹染色体之间的链交换。(4)多种蛋白质促进减数分裂时的同源重组，形成了由多种蛋白质和DNA形成的复合体，被称作重组工厂(recombination factory)。6.1.4.2 基因转换基因转换在同源重组过程中，Holliday中间体拆分时，发生DNA片段的交互重组。在真核生物中，还有另一种机制，基因只发生单向的转移，称基因转换(gene conversion)。交配型转换的机制如图6-9所示，这一过程的第一阶段与同源重组相似，只是进行双链切割的酶是特异性的核酸内切酶，称HO内切核酸酶。链入侵之后，只有其中一个

17、基因(a基因)的序列被复制，另一个基因(基因)的单链序列则被切除。总的结果是基因转换，而不是进行相互交换的基因重组。6.2 位点特异性重组位点特异性重组6.2.1 位点特异性重组的机制位点特异性重组的机制位点特异性重组位点特异性重组(site-specific recombination)指发生在DNA特异性位点上的重组，广泛存在于各类细胞中。其主要作用包括某些基因表达的调节，发育过程中DNA的程序性重排，以及有些病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合与切除等。此过程往往发生在重组位点(20200bp)。位点特异性重组的结果决定于重组位点的位置和方向。如果两个重组位点以相反方向存在于同一DN

18、A分子上，重组的结果是两个重组位点之间的DNA片段发生倒位。若重组位点以相同方向存在于同一DNA分子上，重组结果是两个重组位点之间的DNA片段被切除。(图6-10)。位点特异性重组的主要步骤位点特异性重组的主要步骤(1)两个酶分子通过酪氨酸Tyr-OH进攻识别序列上的1个特定的磷酸二酯键，导致2个DNA分子各有1条链被切开，其中5-磷酸基与Tyr-OH以磷酸酯键相连。(2)两个切点之间发生转酯反应，从而形成Hollida连接，使两个双链分子中各自的一条链发生了交换。(3)在短距离的交叉点迁移后，另外两个酶分子在2个DNA分子上的另一条链上产生切口，反应机理同(1)；(4)反应机理同(2)，通过

19、连接反应，使两个双链分子中各自的另一条链发生了交换。6.2.2 噬菌体噬菌体DNA的整合与切除的整合与切除 噬菌体与宿主的特异重组位点称附着位点(attachment site,att)。整合酶(integrase,INT)，将两DNA分子交互切开，然后再交互连接，整合噬菌体DNA。整合宿主因子(integration host factor,IHF)。切除酶（excision enzyme，XIS）需要将原噬菌休两侧附着位点联结到一起6.2.3 细菌的特异位点重组细菌的特异位点重组鼠伤寒沙门氏杆菌(Sahnunella typhinnurium)的鞭毛蛋白有两种，分别为FljC鞭毛蛋白和Fl

20、jB鞭毛蛋白。同一个细菌不会同时具有两种鞭毛蛋白，但从单菌落的沙门氏菌中经常能出现少数呈另一鞭毛蛋白的细菌细胞，这种现象称为鞭毛相转变。这一转变是由一段995bp的DNA（H片段，H segment)发生倒位引起的。其详细机制将在第11章介绍。IgG的分子结构6.2.4 免疫球蛋白基因的免疫球蛋白基因的V(D)J重组重组 免疫球蛋白(Ig)是B 淋巴细胞合成和分泌的，由两条重链(H)和两条轻链(L)组成。IgH和IgL 的氨基端序列因Ig的抗原结合特异性不同而变化，称可变区(V)，决定Ig 抗原结合特异性。羧基端是恒定区(C)，具有结合补体、巨噬细胞、自然杀伤细胞等特性，介导Ig 的生物学功能

21、。FamilyV GenesC GenesManMouseManMouseLambda64Kappa100098编码Ig 的基因有多个区域组成，IgH 基因由可变区(V)，多样性片段(D)，连接片段(J)，和恒定区(C)片段组成。其中V,D,J编码V区，IgL由V,J,C片段组成。在B细胞发育过程中，V,D和J通过重组连在一起，形成Ig的转录单位。V(D)J重组是B细胞特有的，决定了Ig表达的B细胞特异性。人类IgH基因大约有51个V，27个D和6个J，可产生8262种组合。Ig基因有40个V和5个J，可形成200种组合，Ig基因有30个V和4个J，可形成120种组合。IgH与IgL的组合可达

22、8262(200+120)=2.64 106 种。因此，免疫球蛋白的V(D)J重组是产生抗体多样性的主要机制。6.3 转座重组转座重组6.3.1 转座子的概念转座子的概念 转座重组转座重组(transposition recombination)指DNA上的核苷酸序列从一个位置转移到另外一个位置的现象。发生转座的DNA片段被称为转座子转座子(transposons)或可移位的遗传元件(mobile genetic elements,MGE)，有时还被称为跳跃基因跳跃基因(jump gene)。转座子的主要特征有：能从染色体的一个位点转移到另一个位点，或转移到另一个染色体。不能像噬菌体或质粒那样

23、独立存在。转座子编码其自身的转座酶，移动时携带转座必需的基因一起跃迁。转座的频率很低，且插入是随机的，不依赖于转座子(供体)和靶位点(受体)之间的序列同源性。转座子最初是Barbara McClintock于1940年代在玉米的遗传学研究中发现的，当时称为控制元件(controlling element)。1983年McClintock被授予诺贝尔生理学与医学奖。转座重组的后果：可引起基因组内核苷酸序列发生转移、缺失、倒位或重复，从而导致突变，也可能改变基因组DNA的量。如果转座子插入一个基因的内部？如果插入一个基因的上游？此外，转座子本身还可能充当同源重组系统的底物，原因是在1个基因组内，双

24、拷贝的同一种转座子提供了同源重组所必需的同源序列。转座子在生物体内是普遍存在的，人、小鼠和水稻的基因组有40左右的序列由转座子衍生而来，但在低等的真核生物和细菌内的比例较小，约占1%5。这说明转座子在生物从低等到高等的基因组进化过程中曾发挥过十分重要的作用。不少转座子序列与疾病有关。6.3.2 原核生物的转座子原核生物的转座子 原核生物的转座子最早是在E.coli的半乳糖操纵子内发现的，迄今为止，在细菌内已发现四类转座子。6.3.2.1 第一类转座子第一类转座子第一类转座子是最简单的转座元件，能够从DNA的一个位点插入到另一个位点，因此，被称作插入序列插入序列(insertion sequen

25、ces,IS)。第一类转座子特点：(1)长度较小，通常在700 bp800 bp之间，两端有10 bp40 bp长的反向重复序列IR。(2)内部一般只有一个转座酶基因(transposase,tnpA)。转座酶的量受到严格的调控，它是决定转座频率的主要因素。(3)通过剪切和插入的方式进行转座，经过填补缺口和连结切口，会增加一个拷贝的靶位点序列，完成转座后，插入序列两侧各有一个靶位点序列，呈正向重复。IS类别长度(bp)IR长度(bp)靶位点长度(bp)染色体上的拷贝数F质粒上的拷贝数IS176820/23958IS2132732/41551IS3125839/39352IS4142616/18

26、11,12或141或2IS5119515/164丰富IS10R132917/229表表6-1 E.coli中常见的插入序列中常见的插入序列6.3.2.2 第二类转座子第二类转座子 第二类转座子又称为复杂型转座子复杂型转座子(complex transposon)，特征为：长度较大，通常2.5kb20kb，两侧含有35 bp40 bp的IR序列。内部一般有多个基因，转座酶，解离酶，抗生素抗性基因(resistance gene)。转座可导致靶位点重复。复杂型转座子的靶序列为5bp，转座导致靶位点序列发生重复，结果在转座子两侧形成正向重复序列。转座子抗性标记长度(bp)IR长度(bp)Tnl青霉素

27、4 957Tn3青霉素4 95738Tn501Hg抗性8 20038Tn7甲氧苄氨嘧啶、壮观霉素、链霉素14 00035表表6-2 几种第二类转座子的特征几种第二类转座子的特征6.3.2.3 第三类转座子第三类转座子第三类转座子又名复合型转座子复合型转座子(composite transposon)，由2个IS和一段带有抗生素抗性的间插序列组合而成，其中的2个IS位于转座子的两侧，具有相同或相反的方向。表表6-3 几种第三类转座子的特征几种第三类转座子的特征转座子抗性基因长度(bp)插入序列Tn5抗卡那霉素(KanR)5 700IS50Tn9抗氯霉素(CmR)2 638IS1Tn10抗四环素(

28、TetR)9 300IS106.3.2.4 第四类转座子第四类转座子 第四类转座子的典型例子是Mu噬菌体(Bacteriophage Mu)，它是E.coli的一种温和噬菌体，具有裂解和溶源生长周期。Mu噬菌体的DNA可以通过转座的方式随机整合到宿主DNA中，还可以通过复制型转座，随机插入到宿主DNA的其他区域，它容易诱发宿主细胞的各种突变，因此被称为突变子(mutator)。A基因编码的MuA为转座酶，B基因编码的MuB为ATP酶 MuB还通过与MuA的蛋白质-蛋白质相互作用，阻止MuB结合到已经与MuA结合的DNA区域的附近，使Mu噬菌体周围的DNA不易成为Mu转座子的靶点，这种现象称转座

29、目标免疫(transposition target immunity)。6.3.3 真核生物的转座子真核生物的转座子 转座是真核生物极为普遍的现象。根据转座方式可将真核生物的转座子分为两大类：以DNA-DNA方式转座的转座子，称DNA转座子(DNA transposons)。以DNA-RNA方式转座的逆转录转座子，称逆转录转座子(retrotransposable elements)。DNA转座子可分为3种类型，其共同特点是都具有两个末端反向重复序列。自主型元件：自身能够转座非自主型元件：只有在自主元件存在时才能转座。自主元件与非自主元件通常以一个转座系统转座系统的形式存在于基因组中。拷贝数一

30、般较少。微型反向重复转座元件：MITEs具有IR，不编码转座酶，为非自主DNA类转座子，其序列小(一般为100500 bp)且拷贝高,具有插入位点偏爱性。MITEs具有反转录转座子所具有的高拷贝特点。目前发现的自主元件/非自主元件主要隶属两个超家族。hAT 超家族是Warren等于1994 年发现的3个该类转座子(hobo、Ac 和 Tam3)的第1个字母命名的，包括玉米的Ac/Ds转座系统和金鱼草的Tam3转座子等。其特征是：在转座过程中产生8 bp的靶位点重复。有527 bp的短反向末端重复。大多数hAT类转座子小于4 kb。CACTA超家族最典型的特征是具有长1028 bp的末端反向重复

31、,其末端是保守的CACTA，是转座酶的识别位点。该类转座子包括玉米的En/Spm转座系统和高粱的Candystripe转座子等，最早发现CACTA转座子是水稻的Tnr3，是作为插入片段被鉴定出来的，大小为1539bp，并有13 bp的反向末端重复。6.3.3.1 玉米的控制因子玉米的控制因子 玉米的激活-解离系统(activator-dissociation system,Ac-Ds)是McClintock最先发现的。Ac表示激活子元件(activator element)，属于自主型转座子，约有4563 bp，两端是11 bp的IR序列，带有全功能的转座酶基因。Ds表示解离元件(dissoc

32、iation element)，属于非自主型转座子，两端也是11 bp的IR序列，但中间只有缺失的，无功能的转座酶基因，它实际上是Ac经由不同的缺失突变而来的。有Ac存在时Ds才会移座。玉米种子的颜色由紫色色素基因C决定。如果Ac或Ds插入到C基因内部，则紫色色素基因失活，于是玉米籽粒不能产生紫色色素，而成为黄色。Ac和Ds在染色体上的跳动十分活跃，若在一粒玉米的发育过程中，由于体细胞中Ds的转座，使部分细胞的C基因中含有Ds，另一部分细胞的C基因中没有Ds，玉米籽粒便出现了黄色和蓝色的斑点。6.3.3.2 果蝇的果蝇的p因子和杂种不育因子和杂种不育 p因子是在对果蝇杂种不育(hybrid d

33、ysgenesis)的研究中发现的，是黑腹果蝇的一种自主性转座因子。黑腹果蝇的P品系中含有4050个P因子，而M品系则不含p因子。P因子具有31bp反向末端重复，中间是转座酶。转座酶转座酶p因子的mRNA前体在体细胞和生殖细胞中剪接方式不同，体细胞的剪接保留了第3个内含子。原因是有一种蛋白质结合在第3个内含子上，阻止该内含子的剪接。翻译过程在第3个内含子处中断，产物是一个Mr为66000的蛋白质，它是转座反应的阻遏蛋白。而在生殖细胞中可以剪接除去包括内含子3在内的全部内含子，翻译产物是Mr为87000的转座酶。Hybrid dysgenesis is asymmetrical;it is in

34、duced by P male M female crosses,but not by M male P female crosses.若M雄性 X M雌性，二者均不携带P因子，当然无P因子转座，不会造成后代不育。若P雄性或M雄性 X P雌性果蝇交配，因P雌性果蝇体细胞中存在转座反应阻遏蛋白，也不会造成后代不育。当p雄性X M雌性果蝇交配时，子代体细胞中存在转座反应阻遏蛋白，细胞正常，因而果蝇可以生存。但生殖细胞则存在p因子和转座酶，转座十分活跃。由于转座因子插入新的位点可引起突变，而原来位置失去转座因子也要造成染色体断裂，造成生殖细胞发育不全，因而无生育能力。6.3.3.3 脊椎动物的脊椎动

35、物的DNA转座子：自学转座子：自学6.4 逆转录转座子逆转录转座子在转座过程中需要以RNA为中间体，经过逆转录过程再分散到基因组中的移动因子，称为逆转录子逆转录子(retroposon)或逆转录转座子逆转录转座子(retrotransposon)。在高等生物中，存在很多与逆转录病毒基因组相似的逆转录转座子。6.4.2 逆转录转座子的生物学意义逆转录转座子的生物学意义逆转录转座子广泛分布于真核生物基因组中，对基因组功能有重要影响。6.4.2.1 对基因表达的影响对基因表达的影响逆转录转座子对宿主基因表达的影响与其整合的部位有关，当插入基因的编码序列和启动子序列时，即造成基因失活。逆转录转座子如果

36、插入到基因上游的调控区，如启动子和增强子区，则可使邻近的沉默基因得到表达。6.4.2.2 逆转录转座子介导基因的重排逆转录转座子介导基因的重排分散在真核生物基因组中的大量逆转录转座子是基因组的不稳定因素，它们能引起基因组序列的删除、扩增、倒位、移位及断裂等重排。6.5 转座的分子机制转座的分子机制转座是由转座酶催化的，迄今为止，已发现五类转座酶。具有十分相似的催化机制，完成DNA链的断裂和重新连接。6.5.1 非复制型转座非复制型转座 非复制型转座非复制型转座(non-replicative transposition)又被称作简单转座，将转座子从供体剪切下来，再插入到受体的靶位点上去(图6-

37、24a)。基本过程如图6-24b所示。转座酶与转座子两端的特有序列结合，并使转座子环化形成末端联会。转座酶在转座子两端的特有序列各产生一个单链切口，并在受体位点错位切割DNA双链。连接转座子和受体DNA的末端。经过拆分和修补合成，即可将转座子从供体转移到受体。6.5.2 复制型转座复制型转座复制型转座复制型转座(replicative transposition)是将供体的转座元件复制一份，插入到受体的靶位点。每转座一次，转座元件的拷贝数就增加一个。复制型转座又可分作两类，一类不需要RNA中间物，另一类需要RNA中间物。6.6 P6.6 Polymerase C Chain R Reactio

38、n(PCR)聚合酶链式反应技术Definition of PCR(概念)？PCR is a molecular technique for the PCR is a molecular technique for the in in vitrovitro DNA amplification(DNA amplification(核酸体外扩增技术核酸体外扩增技术).).PCR allows the production of large PCR allows the production of large quantities of a specific DNA from a DNA quanti

39、ties of a specific DNA from a DNA template using a simple enzymatic reaction template using a simple enzymatic reaction without a living organism,such as without a living organism,such as E.coliE.coli or yeast.or yeast.Previously,amplification of DNA involved Previously,amplification of DNA involved

40、 cloning the segments of interest into cloning the segments of interest into vectors for expression in bacteria,and took vectors for expression in bacteria,and took weeks.But now,with PCR done in test tubes,weeks.But now,with PCR done in test tubes,it takes only a few hours.it takes only a few hours

41、.Kary Banks Mullis Khorana(k-rn),is the first person who described the PCR theory-A method using an enzymatic assay to replicate a short DNA template with primers in vitro(1971).Mullis:The invention of the PCR in 1983 is generally credited to Mullis.In recognition of his improvement of the PCR techn

42、ique,he won the 1993 Nobel Prize in Chemistry.PCR Invention History（发明史发明史）PCR principles(原理)Semiconservative Replication(Semiconservative Replication(半保留复半保留复制制)Base pairing provides the mechanism for replicating DNA（碱基配对原则提供了复制的机制）.PCR procedures(PCR循环三步曲)Step 1.Denaturation Step 1.Denaturation(变性

43、变性)9494o oC 30s-1minC 30s-1minStep 2.Annealing Step 2.Annealing(退火退火)55-6055-60o oC 30s-1minC 30s-1minStep 3.ExtensionStep 3.Extension(延伸延伸)7272o oC 30s-1minC 30s-1minPCR cycling:25-40 of these 3 steps cycling PCR procedures(PCR循环三步曲)Denaturation stepDenaturation step（变性变性）:94 for 30S-1min.Unwinding

44、 DNA double helix.It causes melting of the DNA template by disrupting the hydrogen bonds(氢键)between complementary bases,yielding single-stranded DNA molecules.Annealing stepAnnealing step（退火退火）:5065 for 20s1min.Primers specify bind to the single-stranded DNA template.The polymerase binds to the prim

45、er-template hybrid and begins DNA synthesis.Extension/elongation stepExtension/elongation step（延伸）：（延伸）：72 1-2 min.The DNA polymerase synthesizes a new DNA strand complementary to the DNA template strand by adding dNTPs in 5 to 3 direction.Exponential(geometric)amplification(以几何倍数扩增模板)21=222=423=8 2

46、4=16235=34 billionPCR components and reagents(PCR components and reagents(反应五要素)DNA templatePrimersdNTPsTaq polymeraseBuffer solutionDNA template (DNA template (模板模板)that contains the DNA region(target)to be amplified.Two primers(primers(引物引物)that are complementary to the 3 ends of each of the sense

47、 and anti-sense strand of the DNA target.Taq polymerase(Taq polymerase(耐热耐热DNADNA合成酶合成酶)heat-stand.Deoxynucleoside triphosphates(dNTPdNTPs,四种碱基四种碱基),the building-blocks from which the DNA polymerase synthesizes a new DNA strand.Buffer solutionBuffer solution（缓冲液）（缓冲液）providing a suitable chemical en

48、vironment for optimum activity and stability of the DNA polymerase.Divalent cationsDivalent cations：magnesium(Mg2+)or manganese ions(Mn2+);generally Mg2+is used for increasing the activity of the Taq polymerase.PCR components and reagents(反应五要素反应五要素)The Characteristics of PCRSensitivitySensitivity（灵

49、敏性（灵敏性）:exponential(geometric)amplification.Template:ng or pg levelSpecificitySpecificity（特异性特异性）:Specify primers sets decide the target sequence.Fast and Fast and simplifysimplify（快速、简单）（快速、简单）.Adapt to low quality templatelow quality template（对模板（对模板质量要求低）质量要求低）.A thermal cycler for PCRThermal Cyc

50、ler(PCR 仪仪)An older model three-temperature thermal cycler for PCR（最老式的仪，由三个恒温水浴锅组成，使用机械手在三个水浴锅之间移动反应管来实现PCR循环）Variations on the basic PCR techniqueNested PCR(Nested PCR(巢式巢式PCRPCR)uses two sets of primers.The target DNA sequence of inner primers is located within the target sequence of the outer pr