PCR污染产生及防治课件.ppt

1、PCR污染的产生及防治污染的产生及防治分子生物学技术平台讨论会PCR系列之一2019-2-28PCR污染的监测污染的监测 PCR强大扩增能力强大扩增能力+检测的敏感性检测的敏感性经经30个周期后，特定个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增加片段的数量在理论上可增加109倍倍极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题NTCNTC(No Template Control):(No Template Control):必须必须设置一个不含模板设置一个不含模板DNA但含有但含有PCR系统中所有其他成分的对系统中所有其他成分的对照反应，这

2、一对照管须在准备好所有其他照反应，这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加。以后才进行吸加。常见的常见的PCR contamination 常规常规PCR 荧光定量荧光定量PCRNTC432176598NTC引起引起PCR污染的原因污染的原因 模板间交叉污染模板间交叉污染容器被污染模板放置时,由于密封不严溢于容器外容器外粘有模板而造成相互间交叉污染模板吸取过程中,因气溶胶（aerosol）或其他原因引起移液器污染，从而导致交叉污染引起引起PCR污染的原因污染的原因 PCR试剂污染试剂污染PCR 试剂配制过程中,移液器、容器、水等原因造成试剂被PCR 核酸模板污染。引起引起PCR污染的原

3、因污染的原因 PCR产物污染产物污染-最主要最常见最主要最常见PCR 产物拷贝量大，极微量的PCR产物污染,就可形成假阳性。移液器吸取PCR产物进行电泳检测，同一支移液器去准备PCR mixPCR产物的气溶胶污染：一个气溶胶颗粒可能含几万个拷贝气溶胶（aerosol）：悬浮于气体介质中粒径一般为 0.001m1000m的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态散体系。空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及移液器的反复吸样都可形成气溶胶引起引起PCR污染的原因污染的原因 实验室中克隆质粒的污染实验室中克隆质粒的污染克隆质粒浓度高,另外在纯化过程中需用较多的用具及

4、试剂,其污染可能性也很大防止防止PCR污染污染首要原则首要原则 永远要设置永远要设置NTC对照对照 如果不能在污染出现的第一时间发现，会导致严重的如果不能在污染出现的第一时间发现，会导致严重的后果：一大段时间的数据不可信后果：一大段时间的数据不可信 准备准备PCR的移液器要专用的移液器要专用 千万不能千万不能用吸取用吸取PCR产物产物/克隆质粒的移液器去准备克隆质粒的移液器去准备PCR 体系体系防止防止PCR污染污染空间：空间：合理分隔实验区域:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。理想状态：理想

5、状态：各个区域实验用品及移液器专用，实验前应将该区域用紫外线消毒，破坏残留的DNA或RNA。防止防止PCR污染污染操作操作一旦进入吸加PCR试剂的专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套，并应勤于更换。准备专供自己使用的PCR试剂，分装为小份。不要与样品存放在一起。选择质量好的Eppendorf管-密封性好且开管不需要太大力气打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。实验结束后及时清理台面防止防止PCR污染污染移液器操作移液器操作由于操作时不慎将模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样时要十分小心。1）准备PCR的移液器专用2）吸样要慢，吸样

6、时尽量一次性完成，忌多次抽吸，切勿形成喷雾，以免交叉污染或产生气溶胶污染。3）最好在加完所有其他反应成分后才吸加模板。4）推荐在准备PCR过程中使用滤芯枪头 选用含UNG（尿嘧啶DNA糖基酶 Uracil-N-Glycosylase)的试剂，有助于防止PCR产物引起的污染。UNG：50摄氏度，2分钟，作用于含有dU的DNA双链或单链然后开始PCR反应的预变性步骤，同时UNG失活防止防止PCR污染污染对于不含dU的PCR产物无效出现污染后解决办法出现污染后解决办法更换试剂更换试剂 更换新的试剂和水，用确保无污染的移液器分装备用更换新的试剂和水，用确保无污染的移液器分装备用清洁所有可能的污染源：实

7、验台面、小离心机、冰箱门把手等等清洁所有可能的污染源：实验台面、小离心机、冰箱门把手等等 1）实验台面、超净工作台用现配的）实验台面、超净工作台用现配的3%双氧水或双氧水或10%次氯酸钠次氯酸钠溶液擦拭清洁。溶液擦拭清洁。2）或者用）或者用10%漂白粉溶液擦拭漂白粉溶液擦拭 3)紫外光照射，照射距离应不超过紫外光照射，照射距离应不超过90 cm，照射时间最好过夜。，照射时间最好过夜。实验过程中更加小心，采用前面提到的各种防止污染的办法实验过程中更加小心，采用前面提到的各种防止污染的办法参考文献参考文献 Kwok S,Higuchi R.Avoiding false positives with PCRJ .Nature,1989,339(6221):237-238.Mifflin T.E.Setting Up a PCR Laboratory.CSH Protocols;2019;doi:10.1101/pdb14 讨论讨论 设置设置-RT对照后是不是可以不用设对照后是不是可以不用设NTC了？了？使用了滤芯枪头，是否不需要移液器专用了？使用了滤芯枪头，是否不需要移液器专用了？