分子发光分析法课件.ppt

1、第三章第三章 分子发光分析法分子发光分析法 Molecular Luminescence Analysis1本章主要内容本章主要内容 第一节第一节 荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生 第二节第二节 荧光分析方法荧光分析方法 第三节第三节 化学发光分析化学发光分析2 一、生活中的分子发光现象一、生活中的分子发光现象荧光灯荧光灯荧光棒荧光棒荧光笔荧光笔萤火虫萤火虫第一节第一节 荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生3 二、分子发光的概念二、分子发光的概念v室温下，大多数分子处于基态的最低振动能级。处于基态的室温下，大多数分子处于基态的最低振动能级。处于基态的分子分子吸收能量吸收能量后被激发为激发态。激发态

2、不稳定，将很快回后被激发为激发态。激发态不稳定，将很快回到基态。若返回到基态时伴随着到基态。若返回到基态时伴随着光子光子的辐射，这种现象称为的辐射，这种现象称为分子发光分子发光。激发态激发态基基 态态吸收能量吸收能量光辐射光辐射4v分子发光可根据分子受激时所吸收能量来源的不同分为以下分子发光可根据分子受激时所吸收能量来源的不同分为以下几类：几类：v光致发光光致发光:以光源来激发而发光以光源来激发而发光(荧光灯荧光灯,荧光笔荧光笔)v电致发光电致发光:以电能来激发而发光以电能来激发而发光(发光二极管发光二极管)v生物发光生物发光:以生物体释放的能量激发而发光以生物体释放的能量激发而发光(萤火虫萤

3、火虫)v化学发光化学发光:以化学反应能激发而发光以化学反应能激发而发光(荧光棒荧光棒)5v基态分子受到光照激发后，跃迁到激发态，随后放出能量回基态分子受到光照激发后，跃迁到激发态，随后放出能量回到基态。如果能量是以光的形式释放，则会发射出到基态。如果能量是以光的形式释放，则会发射出荧光荧光或或磷磷光光。在光照激发和退激发光的过程中：。在光照激发和退激发光的过程中：分子中的价电子（分子中的价电子（、n电子）电子）处于不同的自旋状态，通常处于不同的自旋状态，通常用用电子自旋状态的多重性电子自旋状态的多重性来来描述。描述。三、三、分子发光的过程（以光致发光为例）分子发光的过程（以光致发光为例）v（1

4、）分子中电子的能级发生了变化。）分子中电子的能级发生了变化。v（2）分子中电子的自旋状态发生了变化。）分子中电子的自旋状态发生了变化。单个电子的两种不同自旋状态单个电子的两种不同自旋状态61.分子中电子自旋状态的多重性分子中电子自旋状态的多重性v大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道中两个电子自旋方向总是相反的旋方向总是相反的，处于基态单重态，处于基态单重态(Singlet state)，用，用“S0”表示表示 ；v当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，当物质受光照射时，基态分子吸收光能产生电子能级跃迁，由由基态跃迁至更高

5、的单重态，电子自旋方向没有改变，基态跃迁至更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋净自旋=0。这种跃迁。这种跃迁产生的概率大产生的概率大。第一激发单重态第一激发单重态 基态单重态基态单重态 轨道轨道轨道轨道n轨道轨道7v若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由基态单若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由基态单重态重态激发三重态激发三重态(Triplet state),净自旋净自旋 0。这种跃迁。这种跃迁产产生的概率小生的概率小。轨道轨道轨道轨道n轨道轨道基态单重态基态单重态 第一激发三重态第一激发三重态 8 2 激发态分子的去活化激发态分子的去活化v处于激发态的分子，通常以处于

6、激发态的分子，通常以辐射跃迁辐射跃迁方式或方式或无辐射跃迁无辐射跃迁方式方式再回到基态，其中以速度最快，激发态寿命最短的途径占优再回到基态，其中以速度最快，激发态寿命最短的途径占优势。势。v辐射跃迁辐射跃迁指以光的形式辐射多余的能量，包括荧光和磷光。指以光的形式辐射多余的能量，包括荧光和磷光。v无辐射跃迁无辐射跃迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫、内转换、外转换和系间跨越等。弛豫、内转换、外转换和系间跨越等。9荧光和磷光体系能级图荧光和磷光体系能级图S0S2S1T1吸光吸光 1吸光吸光 2振动弛豫振动弛豫内转换内转换系间跨越系间跨越荧光荧

7、光 3磷光磷光 4振动弛豫振动弛豫V=3V=2V=1V=0振动弛豫振动弛豫V=3V=2V=1V=0hvhv10 （1）无辐射跃迁去活化过程）无辐射跃迁去活化过程v振动弛豫振动弛豫v在在同一电子能级同一电子能级中，电子由高振动能级跃迁至低振动能级，中，电子由高振动能级跃迁至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出。发生振动弛豫的时间为而将多余的能量以热的形式发出。发生振动弛豫的时间为10-12s数量级。数量级。S0S2S1T1振动弛豫振动弛豫振动弛豫振动弛豫振动弛豫振动弛豫11v内转换内转换v指指相同多重态相同多重态间的无辐射跃迁。当间的无辐射跃迁。当两个电子能级两个电子能级非常靠近以非常靠近以

8、至其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁至其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。内转换过程在方式转移至低能级。内转换过程在10-1310-11s之间。之间。S1S2T1S0内转换内转换12S2S1T1S0v系间跨越系间跨越v指指不同多重态不同多重态间的无辐射跃迁，它涉及受激电子自旋状态的间的无辐射跃迁，它涉及受激电子自旋状态的改变，例如，改变，例如，S1T1，使原来两个自旋配对的电子不再配对。，使原来两个自旋配对的电子不再配对。一般情况下难以发生，但如果两个电子能级的振动能级有较一般情况下难以发生，但如果两个电子能级的振动能级有较大的重叠时，则可以通过

9、系间跨越在不同多重态间进行转移。大的重叠时，则可以通过系间跨越在不同多重态间进行转移。系间跨越系间跨越13外转换外转换v指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为移，使荧光或磷光强度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭熄灭”或或“猝灭猝灭”。14（2）辐射跃迁去活化过程辐射跃迁去活化过程v荧光发射荧光发射v处于激发态的分子放出热能先回到处于激发态的分子放出热能先回到第一激发单重态的最低振第一激发单重态的最低振动能级动能级，然后在，然后在10-910-7s内发射一个光子并返回基态的过内发射一个

10、光子并返回基态的过程。程。S2S1T1吸光吸光 1吸光吸光 2振动弛豫振动弛豫内转换内转换荧光荧光 3S015S0S2S1T1吸光吸光 1吸光吸光 2振动弛豫振动弛豫内转换内转换系间跨越系间跨越荧光荧光 3磷光磷光 4v磷光发射磷光发射v某些单重和三重激发态能级有较大重叠的分子，以放热的某些单重和三重激发态能级有较大重叠的分子，以放热的形式，经系间跨越达到三重激发态，再经振动弛豫到达形式，经系间跨越达到三重激发态，再经振动弛豫到达三三重态的最低振动能级重态的最低振动能级，然后在，然后在10-410s内跃迁回基态并内跃迁回基态并发射磷光。发射磷光。振动弛豫振动弛豫16v荧光和磷光的根本区别是：荧

11、光和磷光的根本区别是：v荧光是由激发荧光是由激发单重态单重态最低振动能级至基态的跃迁产最低振动能级至基态的跃迁产生的；生的；v磷光是由激发磷光是由激发三重态三重态最低振动能级至基态的跃迁产最低振动能级至基态的跃迁产生的。生的。17荧光和磷光测定注意事项：荧光和磷光测定注意事项：避免避免荧光猝灭荧光猝灭消除猝灭剂消除猝灭剂 低温低温 低浓度低浓度荧光物质溶液荧光物质溶液 183 激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱v 激发光谱激发光谱v固定荧（磷）光的发射波长（一般在最大发射波长处），改固定荧（磷）光的发射波长（一般在最大发射波长处），改变激发光波长，测量荧光强度的变化。以激发波长为横坐标，变激

12、发光波长，测量荧光强度的变化。以激发波长为横坐标，荧（磷）光强度为纵坐标作图，即可得到荧（磷）光化合物荧（磷）光强度为纵坐标作图，即可得到荧（磷）光化合物的激发光谱。的激发光谱。v发射光谱发射光谱v简称荧（磷）光光谱，固定激发光波长和强度，在不同波长简称荧（磷）光光谱，固定激发光波长和强度，在不同波长下测定所发射的荧（磷）光强度，以波长为横坐标，以荧下测定所发射的荧（磷）光强度，以波长为横坐标，以荧（磷）光强度为纵坐标，即可得到荧（磷）光光谱。（磷）光强度为纵坐标，即可得到荧（磷）光光谱。19萘的激发光谱、荧光和磷光光谱萘的激发光谱、荧光和磷光光谱 激发光谱激发光谱荧光光谱荧光光谱磷光光谱磷光

13、光谱20荧光发射光谱与吸收光谱的镜像关系荧光发射光谱与吸收光谱的镜像关系吸光吸光荧光荧光250300350400450蒽的乙醇溶液的蒽的乙醇溶液的吸收光谱（左）吸收光谱（左）和荧和荧光光谱（右）光光谱（右）荧光强度荧光强度S0S1V=0123V=02310001020344102030吸光吸光荧光荧光21v荧光发射光谱和它的吸收光谱之间呈镜像对称的原因是：荧光发射光谱和它的吸收光谱之间呈镜像对称的原因是：v吸收光谱吸收光谱是物质分子由基态（一般处于最低振动能级）激发是物质分子由基态（一般处于最低振动能级）激发至第一电子激发态的各振动能级所致，其形状决定于至第一电子激发态的各振动能级所致，其形状

14、决定于第一电第一电子激发态中各振动能级的分布情况子激发态中各振动能级的分布情况。v荧光光谱荧光光谱是激发态分子从第一电子激发态的最低振动能级回是激发态分子从第一电子激发态的最低振动能级回到基态的不同振动能级所致，所以荧光光谱的形状决定于到基态的不同振动能级所致，所以荧光光谱的形状决定于基基态中各振动能级的分布情况态中各振动能级的分布情况。v因为基态中振动能级的分布和第一电子激发态中振动能级的因为基态中振动能级的分布和第一电子激发态中振动能级的分布情况类似，因此荧光光谱的形状和吸收光谱极为相似。分布情况类似，因此荧光光谱的形状和吸收光谱极为相似。22小小 结结1 分子发光的概念和类型分子发光的概

15、念和类型2 荧光和磷光的产生过程荧光和磷光的产生过程3 激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱23思考题思考题1 分子荧光和磷光的产生有何异同？分子荧光和磷光的产生有何异同？2 如何避免荧光猝灭现象的发生？如何避免荧光猝灭现象的发生？24第二节第二节 荧光分析方法荧光分析方法 v分子产生荧光必须具备分子产生荧光必须具备两个条件两个条件：v分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构，才能吸收激发光；（一般来说，收激发光；（一般来说，分子中必须具有大的共轭分子中必须具有大的共轭 键结构）键结构）v吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定吸收

16、了与其本身特征频率相同的能量之后，必须具有一定的荧光量子产率。的荧光量子产率。吸收的光量子数发射的光量子数量子产率25一、物质结构对荧光光谱的影响一、物质结构对荧光光谱的影响1 共轭效应共轭效应v分子结构中具有共轭分子结构中具有共轭 电子的物质，体系中电子的物质，体系中 电子的共轭程度电子的共轭程度越大，则产生的荧光越强，且光谱产生红移。越大，则产生的荧光越强，且光谱产生红移。化合物化合物量子产率量子产率F ex（nm）em（nm）苯苯萘萘蒽蒽丁省丁省戊省戊省0.110.290.460.600.52205286365390580278321400480640262 刚性平面结构刚性平面结构v实

17、验发现，多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的实验发现，多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂荧光。因为这种结构可以减少分子的振动，使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的或其它溶质分子的相互作用减少，也就减少了碰撞去活的可能性。可能性。27 3 取代基效应取代基效应v芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度芳香族化合物苯环上的不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响。和荧光光谱有很大的影响。v给电子基团，如给电子基团，如-OH、-OR、-CN、-NH2、-NR2等，使荧等，使荧光增强。因为产生了

18、光增强。因为产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。v吸电子基团，如吸电子基团，如-COOH、-NO、-C=O、卤素等，会减弱甚、卤素等，会减弱甚至会猝灭荧光。至会猝灭荧光。28二、溶液的荧光强度二、溶液的荧光强度（一）荧光强度和溶液浓度的关系（一）荧光强度和溶液浓度的关系If=Kcv上式中，上式中，If为荧光强度，为荧光强度，K为常数，为常数，c为溶液浓度。为溶液浓度。v这种线性关系只有在极稀的溶液中，即这种线性关系只有在极稀的溶液中，即 lc0.05时，才成立。时，才成立。v进

19、行荧光测定时，和紫外可见吸收光谱一样，应用标准曲线进行荧光测定时，和紫外可见吸收光谱一样，应用标准曲线法定量。法定量。29（二）影响溶液荧光强度的因素（二）影响溶液荧光强度的因素1 溶剂对荧光强度的影响溶剂对荧光强度的影响（1）溶剂极性的影响）溶剂极性的影响v在有些情况下，当溶剂极性增大时，荧光增强，荧光峰红移。在有些情况下，当溶剂极性增大时，荧光增强，荧光峰红移。8-巯基喹啉在不同极性溶剂中的荧光发射情况如下巯基喹啉在不同极性溶剂中的荧光发射情况如下溶剂溶剂 介电常数介电常数 荧光发射峰荧光发射峰/nm荧光量子产率荧光量子产率F四氯化碳四氯化碳 氯氯 仿仿 丙丙 酮酮 乙乙 腈腈2.245.

20、2 21.538.8390398405410 0.0020.0410.0550.06430（2）形成氢键或电离）形成氢键或电离使荧光发射波长和强度改变。使荧光发射波长和强度改变。例如例如VB6在二恶烷中，荧光发射波长在二恶烷中，荧光发射波长335nm在水中（电离），荧光发射波长在水中（电离），荧光发射波长400nm（电离）（电离）（3）溶剂对激发光或荧光有吸收）溶剂对激发光或荧光有吸收如苯、丙酮、酚等在紫外区有吸收，不能作为溶剂如苯、丙酮、酚等在紫外区有吸收，不能作为溶剂312 温度对荧光强度的影响温度对荧光强度的影响v温度上升使荧光强度下降。温度上升使荧光强度下降。v主要有如下原因：主要有如

21、下原因：v（1）随着溶液温度的升高，介）随着溶液温度的升高，介质粘度降低，分子运动速率也质粘度降低，分子运动速率也变大，从而使荧光分子与溶剂变大，从而使荧光分子与溶剂分子或其它分子的碰撞几率增分子或其它分子的碰撞几率增加，外部能量转换速率变大。加，外部能量转换速率变大。因此，荧光量子产率降低。因此，荧光量子产率降低。温温度度降降低低24-19632v（2）分子的内部能量转化作用。当激发分子接受额外热能）分子的内部能量转化作用。当激发分子接受额外热能时，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动时，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。弛豫而丧失振动能量。当激

22、发态分子接受到额外当激发态分子接受到额外热能而沿激发位能曲线热能而沿激发位能曲线AC移动至交点移动至交点C时，有可能转时，有可能转换至基态的位能曲线换至基态的位能曲线NC，使激发能转化为基态的振使激发能转化为基态的振动能，随后通过振动弛豫动能，随后通过振动弛豫而丧失振动能量。而丧失振动能量。能量能量电子与原子核间的距离电子与原子核间的距离33 3 溶液溶液pH值对荧光强度的影响值对荧光强度的影响v（1）影响分子的电离程度）影响分子的电离程度O-OHOHpH9，有荧光，有荧光pH13，无荧光，无荧光v（2）影响金属离子形成的发光螯合物）影响金属离子形成的发光螯合物NNOOGa+NNOOGa-NN

23、OOpH=34时，络合比时，络合比Ga3+:R=1:1，有荧光，有荧光pH=67时，络合比时，络合比Ga3+:R=1:2，无荧光，无荧光34 4 内滤光作用和自吸收现象内滤光作用和自吸收现象v溶液中若存在能吸收激发光或荧光物质所发射荧光的物质，溶液中若存在能吸收激发光或荧光物质所发射荧光的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用内滤光作用”。v荧光物质的荧光发射光的短波长的一端与该物质的吸收光谱荧光物质的荧光发射光的短波长的一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠。在溶液浓度较大时，一部分荧光发射的长波长一端有重叠。在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，

24、产生被自身吸收，产生“自吸收自吸收”现象而降低了溶液的荧光强度。现象而降低了溶液的荧光强度。吸光吸光荧光荧光250 300 350400 450荧光强度荧光强度35三、荧光分析仪三、荧光分析仪36激发光源激发光源 在紫外在紫外-可见区范围，通常的光源是氙灯和高压汞灯。可见区范围，通常的光源是氙灯和高压汞灯。样品池样品池 荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通常用石英，形状荧光用的样品池须用低荧光的材料制成，通常用石英，形状以正方形和长方形为宜。以正方形和长方形为宜。单色器单色器 光栅光栅检测器检测器 由光电管和光电倍增管作检测器，并与激发光成直角。由光电管和光电倍增管作检测器，并与激发光成直角

25、。37四、荧光分析法的特点和应用四、荧光分析法的特点和应用（一）荧光分析法的特点（一）荧光分析法的特点优点优点1.灵敏度高灵敏度高v荧光分析法的灵敏度比吸光分析法高荧光分析法的灵敏度比吸光分析法高24个数量级，检测下个数量级，检测下限在限在0.10.001gmL1之间。之间。2.选择性好选择性好v既可以依据激发光谱，也可以依据发射光谱鉴定某种物质。既可以依据激发光谱，也可以依据发射光谱鉴定某种物质。3.荧光法提供比较多的物理参数荧光法提供比较多的物理参数v可提供包括激发光谱、发射光谱和三维光谱以及荧光强度、可提供包括激发光谱、发射光谱和三维光谱以及荧光强度、荧光效率、荧光寿命等多种物理参数。荧

26、光效率、荧光寿命等多种物理参数。4.试样量少，测定方便试样量少，测定方便38缺点缺点v应用还不够广泛。应用还不够广泛。v这是因为：这是因为：v本身能发射荧光的物质相对较少，用加入某种试剂使非荧本身能发射荧光的物质相对较少，用加入某种试剂使非荧光物质转化为荧光物质来进行分析，其数量也还不多。光物质转化为荧光物质来进行分析，其数量也还不多。v此外，荧光分析的灵敏度高，测定时对环境因素较为敏感，此外，荧光分析的灵敏度高，测定时对环境因素较为敏感，干扰因素较多。干扰因素较多。39（二）荧光分析法的应用（二）荧光分析法的应用1.无机化合物的分析无机化合物的分析 1)直接荧光法直接荧光法 主要是主要是金属

27、元素金属元素+有机试剂有机试剂可发射荧光的配合物可发射荧光的配合物例如：例如：Al3+桑色素桑色素桑色素和桑色素和Al的配合物（可发射荧光）的配合物（可发射荧光）荧光强度一般与待测物浓度成正比。荧光强度一般与待测物浓度成正比。较常用有机试剂进行荧光法测定的元素为铍、铝、硼、镓、硒、较常用有机试剂进行荧光法测定的元素为铍、铝、硼、镓、硒、镁、锌、镉及某些稀土元素等。镁、锌、镉及某些稀土元素等。40 2)荧光猝灭法荧光猝灭法 v某种金属离子某种金属离子M可以与某种有机物生成可发射荧光的配合物可以与某种有机物生成可发射荧光的配合物vM+有机物有机物 M-有机物有机物(可发射荧光可发射荧光)v待测定的

28、金属元素待测定的金属元素X可以取代配合物中的可以取代配合物中的M，生成无荧光的，生成无荧光的配合物配合物vX+M-有机物有机物 X-有机物有机物(无荧光无荧光)+Mv荧光强度一般与待测物浓度成反比。荧光强度一般与待测物浓度成反比。v采用该法测定的元素有氟、硫、氰离子、铁、银、钴、镍、采用该法测定的元素有氟、硫、氰离子、铁、银、钴、镍、铜、钨、钼、锑、钛等。铜、钨、钼、锑、钛等。41 3)间接荧光法间接荧光法 v间接荧光法常用于某些阴离子如间接荧光法常用于某些阴离子如F-、CN-等的分析等的分析vM-有机物有机物(无荧光无荧光)+CN-M-CN+有机物有机物(有荧光有荧光)v2.有机化合物的分析

29、有机化合物的分析 v1)芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发射荧光，可芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发射荧光，可以直接进行荧光测定。例如蛋白质。以直接进行荧光测定。例如蛋白质。v2)对于某些不能发射荧光的分子，可以进行衍生化反应使其对于某些不能发射荧光的分子，可以进行衍生化反应使其结合一个荧光基团从而能够进行荧光检测和分析。例如氨基结合一个荧光基团从而能够进行荧光检测和分析。例如氨基酸分析。酸分析。42五、荧光分析法新技术简介五、荧光分析法新技术简介 1.同步荧光光谱同步荧光光谱v在同时扫描激发光和发射在同时扫描激发光和发射光波长的过程中，使激发光波长的过程中，使激发波长（波长（e

30、x）和发射波长）和发射波长（em）保持固定的波长）保持固定的波长间隔。间隔。432.导数荧光光谱导数荧光光谱v对荧光光谱图求导得到的导数曲对荧光光谱图求导得到的导数曲线。可以在谱图上显示出微小的线。可以在谱图上显示出微小的变化，使光谱图的分辨率得到了变化，使光谱图的分辨率得到了很大的提高。很大的提高。荧光光谱荧光光谱一阶导数光谱一阶导数光谱苯酚水溶液的苯酚水溶液的B带吸收光谱带吸收光谱(a)及其一阶及其一阶(b)、二阶、二阶(c)导数导数443.三维荧光光谱三维荧光光谱v描述荧光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系图谱，描述荧光强度同时随激发波长和发射波长变化的关系图谱，称为三维荧光光谱。称

31、为三维荧光光谱。454.荧光免疫检测荧光免疫检测v使荧光抗体与细胞表面抗原进行反应，洗涤除去游离的荧使荧光抗体与细胞表面抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。的特异荧光。神经元免疫荧光神经元免疫荧光细胞表面特异抗原细胞表面特异抗原465 用于生物芯片的标记用于生物芯片的标记4748小小 结结v通常所说的通常所说的“荧光荧光”分析，其本质是分析，其本质是光致发光光致发光，即依靠光能，即依靠光能来激发分子产生荧光。来激发分子产生荧光。v荧光光谱是荧光光谱是发射光谱发射光谱，因而比紫外可见吸收光谱

32、的灵敏度要，因而比紫外可见吸收光谱的灵敏度要高。高。v荧光光谱的测定过程类似于紫外可见光谱的测定过程。荧光光谱的测定过程类似于紫外可见光谱的测定过程。v进行荧光测定时受到散射光影响。进行荧光测定时受到散射光影响。49第三节第三节 化学发光分析化学发光分析一、化学发光的基本原理一、化学发光的基本原理v在化学反应中，反应产物吸收反应的在化学反应中，反应产物吸收反应的化学能化学能而被激发到激发而被激发到激发态，当跃迁回基态时以态，当跃迁回基态时以光辐射光辐射的形式放出能量称为化学发光。的形式放出能量称为化学发光。v例如：例如：态吸收化学能，成为激发223ONOONO发光强度与发光强度与NO浓度成正比

33、浓度成正比发射出光子hvNONO22501 化学发光的条件化学发光的条件v1）化学反应必须提供足够的激发能，激发能主要来源于反）化学反应必须提供足够的激发能，激发能主要来源于反应焓，大小在应焓，大小在150400 kJmol-1，氧化还原反应氧化还原反应可提供与可提供与此相当的能量。此相当的能量。v2）要有有利的化学反应历程，使化学反应的能量至少能被）要有有利的化学反应历程，使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态。在液相中，一种物质所接受并生成激发态。在液相中，芳香族化合物芳香族化合物和和羰基化合物羰基化合物更容易生成激发态的产物。更容易生成激发态的产物。v3）激发态能释放光子或能

34、够转移它的能量给另一个分子，）激发态能释放光子或能够转移它的能量给另一个分子，而使该分子激发，然后以辐射光子的形式回到基态。而使该分子激发，然后以辐射光子的形式回到基态。512 化学发光的效率化学发光的效率01.0参加反应的分子数发射光子的分子数3 化学发光的强度化学发光的强度v在某一时刻在某一时刻t，发射光的强度，发射光的强度I与化学反应的速度成正比。与化学反应的速度成正比。对于一级动力学反应，发光强度对于一级动力学反应，发光强度I与与t时刻的反应物浓度成时刻的反应物浓度成正比。正比。需要高灵敏度的光检测器需要高灵敏度的光检测器)(BAkdtdCtI分析物浓度化学反应速率常数分析物参加反应的

35、速率化学发光效率,BAkdtdC52二、化学发光的类型二、化学发光的类型1 直接化学发光和间接化学发光直接化学发光和间接化学发光v直接化学发光直接化学发光hvCCDCBAv间接化学发光间接化学发光hvFFEFFCDCBA被测物被测物A或或B作为反应物生成作为反应物生成激发态产物激发态产物C*，C*直接辐射直接辐射出光子。出光子。被测物被测物A或或B作为反应物生成作为反应物生成激发态产物激发态产物C*，C*不直接发不直接发光，而是将其能量转移给光，而是将其能量转移给F，使使F处于激发态处于激发态F*，当，当F*跃迁跃迁回基态时，产生发光。回基态时，产生发光。53 2 气相化学发光和液相化学发光气

36、相化学发光和液相化学发光v气相化学发光气相化学发光v主要有主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、NO2、H2S、SO2、CO等。等。v液相化学发光液相化学发光v用于此类化学发光分析的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉用于此类化学发光分析的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉碱等。例如，利用发光物质鲁米诺，可测定痕量的碱等。例如，利用发光物质鲁米诺，可测定痕量的H2O2以以及及Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce等金属离子。等金属离子。54三、化学发光的装置和应用三、化学发光的装置和应用光检测器光检测器放大器放大器信号输出信号输出装置装置高压

37、稳压高压稳压电源电源样品室样品室样品池样品池1 化学发光的装置化学发光的装置55 2 化学发光的应用化学发光的应用v化学发光分析最大的特点是灵敏度高；化学发光分析最大的特点是灵敏度高；且能够进行快速连续且能够进行快速连续分析。分析。v例如，监测空气中有害物质如例如，监测空气中有害物质如O3、氮氧化物、氮氧化物、CO、SO2、H2S等的灵敏度可达等的灵敏度可达13 ngcm-3。v鲁米诺、光泽精、没食子酸等发光体系可测定水中的金属离鲁米诺、光泽精、没食子酸等发光体系可测定水中的金属离子含量。灵敏度可达子含量。灵敏度可达0.2 ngcm-3。间接测定葡萄糖间接测定葡萄糖间接测定氨基酸间接测定氨基酸56某些物质生物发光分析的检测水平某些物质生物发光分析的检测水平 化化 合合 物物 检测水平检测水平/10-12 molNADH NADPH 6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 乙醇乙醇 睾酮睾酮 雄酮雄酮 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 葡萄糖葡萄糖6磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶 乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶 已糖激酶已糖激酶 氨甲蝶呤氨甲蝶呤 三硝基甲苯三硝基甲苯 0.510000.510002100(0.0030.012)10-20.810000.810000.00110.00110.001100.00110.52 10 amol(a=10-18)5758