1、 双双脱氧末端终止脱氧末端终止法法 测序测序的原理的原理主讲：氧气主讲：氧气yunyunFrederickSanger双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法l DNA聚合酶不能从聚合酶不能从头合成子链头合成子链l 如果如果dNTP的的3碳上碳上没有羟基没有羟基l ddNTP双脱氧双脱氧核苷酸核苷酸基本原理：基本原理：l DNA复制l ddNTP的结构l 聚丙烯酰胺凝胶电泳DNA复制的特点复制的特点酶：DNA聚合酶模板：单链DNA底物：dNTP引物：需要引物的作用：提供3羟基末端ddNTP的特点的特点l DNA聚合酶不聚合酶不能够区分能够区分dNTP和和ddNTP。l ddNTP 3位不是位不是-OH
2、，但，但5磷酸基磷酸基团正常。团正常。l ddNTP参入到寡参入到寡核苷酸链的核苷酸链的3末端末端后，后，DNA链链的延的延长会长会被迫停止被迫停止。聚丙烯酰胺凝胶电泳特点聚丙烯酰胺凝胶电泳特点精度相当高！精度相当高！能分离长度达能分离长度达300-500个碱基，个碱基，而差别仅一个而差别仅一个碱基的同系单碱基的同系单链核苷酸序列。链核苷酸序列。操作步骤操作步骤1制备制备单单链模板与引物退火链模板与引物退火2链链延伸延伸-终止终止反应反应3.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳4.放射自显影放射自显影5.阅读阅读测序结果测序结果制备制备单链模板与引物退火单链模板与引物退火双链双链DNA单链单链
3、DNA单链单链DNA加入加入引物，引物，加热，退火加热，退火带引物的模板单链带引物的模板单链DNA链延伸链延伸-终止反应终止反应带引物的模板单链带引物的模板单链DNA核素标记核素标记的的dNTP分成四管分成四管双脱氧鸟苷双脱氧鸟苷双脱氧腺苷双脱氧腺苷双脱氧胸苷双脱氧胸苷双脱氧胞苷双脱氧胞苷37下反应下反应5min后加入后加入EDTA使使DNA聚合酶失活聚合酶失活含有各种长度含有各种长度DNA分子的溶液分子的溶液 EDTA 乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸，一种二价金属一种二价金属离子螯合剂，离子螯合剂，DNA聚合酶对聚合酶对Mg2+浓度十分浓度十分敏感。敏感。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳含有各种长度含有各种长度DNA分子的溶液分子的溶液95加热加热 变性变性冰上冰上冷却冷却点样点样开始电泳开始电泳电泳完成，得到凝胶电泳完成，得到凝胶放射自显影放射自显影电泳完成，得到凝胶电泳完成，得到凝胶固定凝胶固定凝胶真空抽干真空抽干放入放入X射线片夹射线片夹得到得到X射线片射线片与照相与照相机机原理原理相似相似，利用射线利用射线使胶片使胶片感感光，然后光，然后通过显影通过显影过程把过程把“像像”显示显示出来出来。阅读测序结果阅读测序结果一般是从下往上阅一般是从下往上阅读读X射线片上的显射线片上的显影区带，即从测序影区带，即从测序引物的引物的5端读向端读向3端。端。
