间接免疫荧光法测标准课件.pptx

1、抗核抗体抗核抗体n【自身抗体自身抗体】：指抗自身组织、器官、细：指抗自身组织、器官、细胞及其成分的抗体胞及其成分的抗体n【ANAANA】：指抗细胞核成分（：指抗细胞核成分（DNADNA，RNARNA，蛋，蛋白质和酶）的抗体。白质和酶）的抗体。ANAANA存在一个谱存在一个谱nANAANA新概念：抗核酸（新概念：抗核酸（Nucleic acidNucleic acid）和核）和核蛋白（蛋白（NucleoproteinNucleoprotein）抗体的总称）抗体的总称n某些核抗原成分在核仁和胞浆内比核质内某些核抗原成分在核仁和胞浆内比核质内更丰富更丰富ANA检测的意义检测的意义n有助于疾病的诊断

2、如抗Sm是SLE标记抗体；抗ScL-70 是SD的标记抗体；抗Jo-1是PM/DM的标记抗体；n观察疾病活动度和治疗反应n研究发病机理【ANAANA分类分类】n抗抗DNADNA（dsDNA,ssDNA)dsDNA,ssDNA)n抗组蛋白（抗组蛋白（Histone)Histone)n抗非组蛋白（抗非组蛋白（Nonhistone,Extractable Nonhistone,Extractable Nuclear Antigen,ENANuclear Antigen,ENA）n抗核仁（抗核仁（NucleolusNucleolus）几种ENA的由来及同义词nSm：病人名：SmithnRNP:u1 R

3、NP或nRNP Nuclear RibonucleoproteinnSSA:RO Sjogrens syndrome AnSSB:La,Ha,Sjogrens syndrome BnJo-1:病人JohnnScL-70:Scleroderma【ANA ANA 由由 来来】中性粒细胞DNP(DNA-Histone)+抗DNP+补体均质体LE细胞LE细胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等结缔组织病，药物过敏，慢活肝等亦可阳性。抗DNP取代LE细胞的检测+ANA的筛选：间接免疫荧光法的筛选：间接免疫荧光法+抗原抗体（血清）抗原抗体第二抗体ANA的筛选：间接免疫荧光法实验原理：实验原理：生物薄

4、膜载片生物薄膜载片上的上的IgAIgA、IgGIgG、IgMIgM类类特特异性抗体异性抗体可以与可以与抗核抗原抗核抗原反应；随后反应；随后，结合抗体可与，结合抗体可与标记荧光的二抗标记荧光的二抗进行进行反应，并可在荧光显微镜下观察。反应，并可在荧光显微镜下观察。抗原抗原人特异性抗体FITCFITC标记的抗人抗体标记的抗人抗体FITCFITC FITCFITC载片载片实验原理：实验原理：生物薄片马赛克生物薄片马赛克TM技术技术【实验步骤实验步骤】实验步骤一：准备实验步骤一：准备p检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？如果不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可使用家用洗涤剂，再用水彻底冲洗。需要消毒时，可于

5、3的Sekusept Extra（汉高公司）中浸泡1小时。p只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。不要触及生物薄片。按照要求用记号笔对玻片进行标记。实验步骤二：样品准备实验步骤二：样品准备l1:100稀释血清标本。每次实验均需加入阳性和阴性对照。对照血清使用前必须混匀。实验步骤三：加样实验步骤三：加样n在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育。使用聚苯乙烯加样板。n加样体积:25 l/反应区(5 x 5 mm)12345样品1样品2样品3阳性对照阴性对照实验步骤四：孵育实验步骤四：孵育n将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即开始。确保每个标本均能够与生物薄片相

6、接触，而标本之间不相互接触。室温（18-25）温育30分钟。实验步骤五：冲洗实验步骤五：冲洗n 用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水流水冲洗载片，然后立即立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少至少5分钟分钟。检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。Jo-1:病人John抗核仁（Nucleolus）ANA的筛选：间接免疫荧光法绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。阴性，标本中未检测到抗核抗体RNP:u1 RNP或nRNP Nuclear Ribonucleoprotein从现在开始，注意避免阳光直射载片。然后再进行下一个载片的操作。只有当载片

7、平衡到室温后方可打开袋子。滴度定义：与相同稀释倍数的阴性血清相比，能观察到特异性荧光反应的最高稀释度ANA新概念：抗核酸（Nucleic acid）和核蛋白（Nucleoprotein）抗体的总称混合结缔组织病（100%）活动性SLE （95-100%）抗组蛋白（Histone)SSB:La,Ha,Sjogrens syndrome B只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。阴性，标本中未检测到抗核抗体几种ENA的由来及同义词实验步骤六：加样实验步骤六：加样n 将20l荧光标记的抗人球蛋白荧光标记的抗人球蛋白（荧光二抗）加入洁净加样板洁净加样板的每个反应区。完完全加完所有的二抗后全加完所有的二抗后

8、，方可继续温育方可继续温育（最多可加50个载片）。建议使用连续建议使用连续加样器加样器。加样前应使用加样器混匀混匀。为为节约时间，可在第一步温育的同时滴加节约时间，可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加样板的反应区中。酶结合物至另一个加样板的反应区中。实验步骤七：孵育实验步骤七：孵育n 从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片取出一张载片，5秒钟秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立立即即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。n注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区不要擦拭反应区的间隙。的间隙。n检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。n从现在开始，注意避免阳光直射载

9、片。从现在开始，注意避免阳光直射载片。n室温温育30分钟分钟。实验步骤八：冲洗实验步骤八：冲洗n用烧杯盛PBS-Tween缓冲液，流水流水冲洗载片，然后立即立即放入装有PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗至少浸洗至少5分钟分钟。n可在每150ml磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液中加10滴(150 l)伊文氏蓝伊文氏蓝进行复染复染。实验步骤九：封片实验步骤九：封片n 在盖玻片盖玻片上滴加甘油甘油/PBS。n封片体积:10 l/反应区(5 x 5 mm)n从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片取出一张载片，用纸擦干擦干背面和四边，注意不要擦拭反应注意不要擦拭反应区间隙。区间隙。n将载片的生物薄片朝

10、下置于准备好的盖玻片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。n然后再进行下一个载片的操作。实验步骤十：结果判断实验步骤十：结果判断荧光显微镜下观察荧光。结果判读：结果判读：n荧光显微镜下观察荧光显微镜下观察n 细胞核发细胞核发黄绿色荧光黄绿色荧光为为阳性阳性染色细胞，染色细胞，不不发荧光发荧光为为阴性阴性。n抗原片中出现阳性染色细胞为抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，阳性，否则为阴性。否则为阴性。n阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。【均质型均质型】细胞核呈均匀一致的荧光细胞核呈均匀一致的荧光【核仁型核仁型】核仁部分呈

11、现荧光核仁部分呈现荧光【斑点型斑点型】(颗粒型颗粒型)细胞核内呈现斑点状荧光细胞核内呈现斑点状荧光【胞浆型胞浆型】FITC标记的抗人抗体进行性系统硬化症 （85-95%）混合结缔组织病（100%）ScL-70:Scleroderma抗DNA（dsDNA,ssDNA)提示某种风湿病或其他疾病Jo-1:病人John注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区的间隙。从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。ANA的筛选：间接免疫荧光法对于核均质性、着丝点、核点型等荧光模式，提示某种风湿性疾病或其他疾病【ANA】：指抗细胞核成分（DNA，RNA，蛋白质和酶）

12、的抗体。室温（18-25）温育30分钟。SSB:La,Ha,Sjogrens syndrome B阴性，标本中未检测到抗核抗体抗核仁（Nucleolus）细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。ANA的筛选：间接免疫荧光法【着丝点型着丝点型】混合型：存在两种以上的类型混合型：存在两种以上的类型 混合型：存在两种以上的类型混合型：存在两种以上的类型ANA结果判断结果判断1：100 阴性阴性，标本中未检测到抗核抗体1：100 阳性微量对于核均质性、着丝点、核点型等荧光模式，提示某种风湿性疾病或其他疾病1：

13、320 阳性阳性提示某种风湿病或其他疾病滴度定义：滴度定义：与相同稀释倍数的阴性血清相比，能观察与相同稀释倍数的阴性血清相比，能观察到特异性荧光反应的最高稀释度到特异性荧光反应的最高稀释度【临床意义临床意义】n总的总的ANA检测在临床诊断与鉴别诊断中是一检测在临床诊断与鉴别诊断中是一个极为重要的个极为重要的筛选筛选试验。绝大多数自身免疫试验。绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。性疾病均可呈阳性。ANA阳性者进一步检测阳性者进一步检测各亚类各亚类ANA抗体对明确诊断、临床分型、病抗体对明确诊断、临床分型、病情观察、预后及治疗评价有重要意义。情观察、预后及治疗评价有重要意义。n未经治疗的、活动性未经

14、治疗的、活动性SLE的阳性率为的阳性率为80%100%。药物性狼疮。药物性狼疮100%、全身硬皮病、混、全身硬皮病、混合性结绨组织病、狼疮性肝炎、原发性胆汁合性结绨组织病、狼疮性肝炎、原发性胆汁性肝硬化等。性肝硬化等。n干燥综合症（干燥综合症（SS）、类风关、桥本甲状腺炎）、类风关、桥本甲状腺炎等。等。活动性SLE （95-100%）非活动性SLE（80-100%）药物诱导的红斑狼疮（100%）混合结缔组织病（100%）类风湿关节炎（20-40%）其他风湿性疾病（20-50%）进行性系统硬化症 （85-95%）多肌炎、皮肌炎（30-50%）干燥综合征 （70-80%）慢性活动性肝炎（30-40

15、%）溃疡性结肠炎（26%）Thank You!Thank You!实验步骤三：加样实验步骤三：加样n在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育。使用聚苯乙烯加样板。n加样体积:25 l/反应区(5 x 5 mm)12345样品1样品2样品3阳性对照阴性对照实验步骤七：孵育实验步骤七：孵育n 从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片取出一张载片，5秒钟秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立立即即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。n注意：为防止破坏基质，不要擦拭反应区不要擦拭反应区的间隙。的间隙。n检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一

16、张。n从现在开始，注意避免阳光直射载片。从现在开始，注意避免阳光直射载片。n室温温育30分钟分钟。实验步骤十：结果判断实验步骤十：结果判断荧光显微镜下观察荧光。【胞浆型胞浆型】抗核仁（Nucleolus）FITC标记的抗人抗体慢性活动性肝炎（30-40%）抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。抗核仁（Nucleolus）只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。Thank You!室温（18-25）温育30分钟。ANA新概念：抗核酸（Nucleic acid）和核蛋白（Nucleoprotein）抗体的总称荧光显微镜下观察荧光。然后再进行下一个载片的操作。绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性

17、。从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。SSB:La,Ha,Sjogrens syndrome BSSB:La,Ha,Sjogrens syndrome B加样体积:25 l/反应区(5 x 5 mm)如抗Sm是SLE标记抗体；LE细胞：并非SLE特有，PM、SD、RA、SS等结缔组织病，药物混合结缔组织病（100%）绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。ANA结果判断结果判断1：100 阴性阴性，标本中未检测到抗核抗体1：100 阳性微量对于核均质性、着丝点、核点型等荧光模式，提示某种风湿性疾病或

18、其他疾病1：320 阳性阳性提示某种风湿病或其他疾病滴度定义：滴度定义：与相同稀释倍数的阴性血清相比，能观察与相同稀释倍数的阴性血清相比，能观察到特异性荧光反应的最高稀释度到特异性荧光反应的最高稀释度阴性，标本中未检测到抗核抗体检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。类风湿关节炎（20-40%）抗核仁（Nucleolus）对照血清使用前必须混匀。绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。阴性，标本中未检测到抗核抗体滴加完所有待测标本后才开始温育。从现在开始，注意避免阳光直射载片。ANA的筛选：间接免疫荧光法混合结缔组织病（100%）荧光显微镜下观察荧光。从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一

19、张载片，用纸擦干背面和四边，注意不要擦拭反应区间隙。RNP:u1 RNP或nRNP Nuclear Ribonucleoprotein抗DNA（dsDNA,ssDNA)对于核均质性、着丝点、核点型等荧光模式，提示某种风湿性疾病或其他疾病【自身抗体】：指抗自身组织、器官、细胞及其成分的抗体阴性，标本中未检测到抗核抗体观察疾病活动度和治疗反应抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。需要消毒时，可于3的Sekusept Extra（汉高公司）中浸泡1小时。FITC标记的抗人抗体观察疾病活动度和治疗反应在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。阴性，标本中未检测到抗核抗体ANA新概念：

20、抗核酸（Nucleic acid）和核蛋白（Nucleoprotein）抗体的总称提示某种风湿病或其他疾病抗组蛋白（Histone)荧光显微镜下观察荧光。绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。抗组蛋白（Histone)混合型：存在两种以上的类型滴加完所有待测标本后才开始温育。从现在开始，注意避免阳光直射载片。【均质型】细胞核呈均匀一致的荧光对于核均质性、着丝点、核点型等荧光模式，提示某种风湿性疾病或其他疾病室温（18-25）温育30分钟。加样体积:25 l/反应区(5 x 5 mm)从PBS-Tween 清洗缓冲液中取出一张载片，5秒钟内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即将载片覆有生物薄片的一面朝下

21、，盖在加样板的凹槽里。绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。绝大多数自身免疫性疾病均可呈阳性。RNP:u1 RNP或nRNP Nuclear Ribonucleoprotein阴性，标本中未检测到抗核抗体混合结缔组织病（100%）ANA新概念：抗核酸（Nucleic acid）和核蛋白（Nucleoprotein）抗体的总称抗原片中出现阳性染色细胞为ANA阳性，否则为阴性。将20l荧光标记的抗人球蛋白（荧光二抗）加入洁净加样板的每个反应区。对于核均质性、着丝点、核点型等荧光模式，提示某种风湿性疾病或其他疾病干燥综合征 （70-80%）抗组蛋白（Histone)抗核仁（Nucleolus）RNP:u1 RNP或nRNP Nuclear Ribonucleoprotein只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。【均质型】细胞核呈均匀一致的荧光抗DNA（dsDNA,ssDNA)某些核抗原成分在核仁和胞浆内比核质内更丰富在加样板的每个反应区加入稀释血清，避免产生气泡。对于核均质性、着丝点、核点型等荧光模式，提示某种风湿性疾病或其他疾病如抗Sm是SLE标记抗体；抗组蛋白（Histone)Thank You!Thank You!