凝胶层析原理课件.ppt

1、小 结 名称 原理 电极缓冲液 支持介质 电泳形式 加样方式 染色液 分辨率 醋酸纤维素电泳 琼脂糖凝胶电泳 PAGE IEF SDS-PAGE 层层 析析 CHROMATOGRAPHY CHROMATOGRAPHY 一、概述 1、定义 层析(又名色谱)一种利用混合物中各组分的 物理化学性质间的差异，使各组分在层析两相中以不同程度分配，借此将各组分分离。分子极性 分子大小 分子形状 离子亲和力分子亲和力吸附能力 凝胶层析 离子交换层析 亲和层析 2 2、物理化学性质间的差异、物理化学性质间的差异 吸附层析 L L 层析分析法的基本原理：层析分析法的基本原理：流动相 Mobile phase 固

2、定相 Stationary phase 样本分子依其分子极性 选择亲和两相之一 吸附层析 分配层析 Liquid-Solid Liquid-Liquid 两相系统 A B C 每次分离样本 都要做一次选择 One Plate of Separation(理论板数)S 极 性 L 非 极 性 极 性 非 极 性 样本 样本?1903年 俄国植物学家 茨维特 发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带;3 3、层析的发展、层析的发展 19311931年，KuhnKuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素 1941年，Martin和Synge提出分配色谱法 19441944

3、年，Martin等又提出纸色谱法 19521952年，Martin和JamesJames发明了气液色谱法 19551955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代 色谱分析的建立 1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法(TLC)19581958年，SteinStein和MooreMoore研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核酸的分子结构 19671967年，Horvvath和HuberHuber等研制了高效液相色谱(high-(high-performance liquid chromatography,HPLC)performance liquid chromatography,HPLC)仪

4、19751975年，SmallSmall等提出离子色谱 20世纪80年代，超临界色谱 20世纪9090年代，毛细管电泳（18091809年Re?ssss第一次电泳实验）21世纪，联用技术、大分子色谱分离、制备色谱可望取得更大的发展 层析法进行时有两个相，一个相层析法进行时有两个相，一个相称为固定相固定相，另一相称为流动相。支持物 含待分离物质 气 相 层 析 液 相 层 析 气-固 气-液 液-固 液-液 二.层析技术的分类 1.按两相所处的状态分类 以气体作为流动相 以液体作为流动相 2.2.按层析的机制可分为按层析的机制可分为?吸附层析adsorption chromatography?分

5、配层析partition chromatography?凝胶层析gel chromatography?亲和层析affinity chromatography?离子交换层析 ion-exchange chromatography?定义 指混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质的吸附力而使混合物分离的方法?原理 在不同条件下，吸附剂与被吸附物之间的作用 物理作用的范德华吸附：无选择性，吸附速度快，吸附的过程是可逆的 化学吸附：由原子价力的作用引起。有选择性，吸附速度较慢，不易解吸（1）吸附层析 在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态

6、平衡，吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸 吸附层析吸附层析?常用的吸附剂 硅胶 碱性:碳氢化合物 中性:醛,酮,醌,酯,内酯酸性:酸性色素,醛,酸 聚酰胺 氧化铝 活性炭 磷酸钙 粉末:吸附力大,流速慢 颗粒:吸附力中,流速易控 锦纶-活性炭:吸附力弱 锦纶6666或锦纶6 6 酰胺基团 对酚,DNP-氨基酸,醌,羧酸 氢键：羟基与羰基 唯一用于生物活性物质 羟基磷灰石（2）分配层析）分配层析 利用不同组分 在流动相和固定相中的分配系数不同而进行分离的方法。?柱层析colum chromatography 进样量大且容易回收?薄层层析thin layper chromatograp

7、hy 小量样品，快速，操作简便 3.按制备量分类 层析法的演变过程：圆形滤纸 长条滤纸 薄层层析 (TLC)(TLC)柱层析 容量变大 容量更大 加展开液 纸层析纸层析 薄层层析 三.层析的一般原理 1.分配系数Partition coefficient 表示一种物质在两种特定相（流动相和固定相）中分配程度 溶质在固定相中的浓度 Cs K=溶质在流动相中的浓度 Cm 特定的温度：常数 K大：被固定相吸附的牢固，随流动相 的移动速度较慢。纯化生物物质的纯度纯化生物物质的纯度 取决于混合物中各组分取决于混合物中各组分K 值的差异程度值的差异程度 混合物中各组分若混合物中各组分若 K值相差较大,则能

8、较易地把混合物中的生物物质分离较易地把混合物中的生物物质分离。反反之之,K值相差较小值相差较小,不易把混合物中的生物物不易把混合物中的生物物质分离质分离 1 2 3 4 5 K=1 K=0.1 32 16 16 8 16 8 4 12 12 4 2 8 12 8 2 90 10 100 1 18 81 0.1 2.7 24.3 72.9 0.01 0.36 4.86 29.16 65.61 凝胶层析凝胶层析 Gel Chromatography 凝胶过滤 （gel filtration）(Porath,Flodin,1959)分子筛层析（molecular sieve chromatograp

9、hy）(Hjertn,Mosbach,1962)排阻层析 （exclusion chromatography）(Pedersen,1962)指混合物随流动相经固定相的层析柱时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。一、基本原理一、基本原理 固定相（凝胶）?三维空间网状结构 A good gel for gel filtration contains about 95%water 凝胶层析法：样品 固 定 相 流 动 相 小分子 被延滯 小分子 大分子 较快流出 分子筛效应：分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。凝胶层析过程的数理关系

10、1、柱床体积(VT)VT=1/4?D2h 2、洗脱体积（Ve）?即欲分离物质通过层析柱洗脱下来所需洗脱液的总体积。3、外水体积（V0）即存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中流动相的体积。4、内水体积（Vi）即凝胶颗粒内部所含水相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量求得。5、凝胶干体积（Vg）柱床体积VT 凝胶干体积Vg 内水体积Vi 存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中流动相的体积。颗粒内部所含水相的体积它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量相减求得。凝胶体积以及颗粒内外间隙体积的总和。VT=1/4?D2h 外水体积V0 VT =Vg+V0+Vi 数理关系

11、 Ve Vo Kd=Vi 6、分配系数（Kd）：特点：（1）与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关 （2）与柱的长短粗细无关 每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数（Kd）Ve=Vo+KdVi(2)Ve=Vo+Vi Kd=1?分子完全不被排阻?完全向凝胶颗粒内部扩散部扩散?在两相分配的比值为为1,最后流出最后流出.(1)Ve=Vo(1)Ve=Vo Kd=0 Kd=0?分子完全被排阻分子完全被排阻于凝胶颗粒之外于凝胶颗粒之外?全部分布于流动全部分布于流动相里相里,?最先流出。最先流出。(3)0 Kd 1 Ve=Vo+ViKd Ve=Vo+ViKd?为溶质以某种程度为溶质以某

12、种程度向凝胶颗粒内扩散向凝胶颗粒内扩散 Kd=0 0Kd1 Kd=1 洗脱体积 三.凝胶层析的优点 1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定 2.操作条件较温和。3.样品得率高,重复性好,可进行大量样品的分离纯化 四、凝胶层析的缺点 1.要求样品和洗脱液的粘度很低 2.凝胶颗粒网络 孔径大小非常有限,所以可被纯化的物质的 分子量范围受到限制 3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用 五、凝胶的结构与性能 1.葡聚糖凝胶 1959年Porath和Flodin合成（商品名为Sephadex）（1）结构：基本骨架：葡聚糖（dextran）交联剂：3-氯代-1,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚

13、合而成的 三维空间网状结构 （2）特点：）特点：交联度：?交联剂越多 交联度越大 网孔结构越紧密?交联剂越少 交联度越小 网孔结构越疏松 化学性质：稳定,不溶于水、盐、弱酸、碱和一般有机溶剂,耐热耐碱不耐强酸 （2）特点：Sephadex的分级范围 G10 700 G15 1,500 G25 1,000-5,000 G-50 1,500-30,000 G-75 3,000-70,000 G100 4,000-150,000 G150 5,000-400,000 G200 5,000-800,000 吸水性?G类的型号 表示每克干凝胶吸水量（ml）x10 如G-50 每克干凝胶吸水量为5ml?大

14、孔凝胶?工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限?可分离MW40万以上的物质?可用来分离核酸及病毒。2.琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose)3.聚丙烯酰胺凝胶 各 种 层 析 胶 体：Pharmacia Sephadex Sepharose Sephacryl Sephacel glucose agarose glucose+acrylamide cellulose Bio-Rad BioGel P BioGel A acrylamide agarose 六.其它条件选择 1.柱的选择 柱短而粗,则易使样品稀释,柱长而窄,则柱的管壁效应较大,会造成拖尾现象 2.样品的选择：量适当,粘度

15、小 3.洗脱液的选择：每种样品分离所用的缓冲洗脱液应根据 使样品稳定的原则使用 七、应用 1.分离纯化 2.脱盐 3.测分子量 Elution volume(ml)Albumin NaCl?Desalting in a simple column 测分子量测分子量 Ve log Mr 对同一类型的化合物,洗脱特性与组分的分子量有关,流过凝胶柱时,按分子量(MW)大小顺序流出,MW大的走在前面,Ve与MW的关系可用下式表示:Ve=K1-K2lgMW K1,K2 为常数,MW为分子量 实验：实验：凝胶层析法分离蛋白质 血红蛋白 64,480 二硝基苯-鱼精蛋白 2,000-12,000 Sepha

16、dex G-50 孔径 1,500-30,000 一、原理：一、原理：Kd=0 Kd=1 1、装柱 先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积 凝胶不能有气泡和分层现象 装柱结束后要保持凝胶表面平整 二、操作注意点：二、操作注意点：凝胶柱的装填方法：凝胶柱的装填方法：装 填 胶 体 暂 停 流 洗 X X 继 续 流 洗 已 堆 积 沉 淀 中 上 清 紧 密 堆 积 检 查 好 管 柱 是 否 畅 通 1 2 Gel Gel 继 续 流 洗 2、加样、加样 使液面和凝胶表面相切，关闭出口 加样时尽量不要破坏凝胶面 让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱 血红蛋白和二硝基苯-鱼精蛋白的洗脱体积？三、结果要求：三、结果要求：