《动物分子生物学》教学课件：第八章-动物的分子标记及应用.ppt

1、第八章 动物遗传标记及应用Genetic markers and application表型差异标记(genetic marker)基因遗传差异LandmarkLandmark一.遗传标记的概念及发展1.遗传标记的概念标记(Marker):某个体与其它个体相区别的标志。某个体与其它个体相区别的标志。遗传标记（genetic marker）广义概念：受基因控制，能表达生物的变异性且能稳定遗传、可受基因控制，能表达生物的变异性且能稳定遗传、可被检测的各个性状。包括形态学、生化学、免疫学、被检测的各个性状。包括形态学、生化学、免疫学、细胞学和分子水平几个方面。细胞学和分子水平几个方面。狭义概念：指指

2、分子标记分子标记，即在遗传分析上用作标记的基因。是以，即在遗传分析上用作标记的基因。是以个体间遗传物质即核苷酸序列变异为基础的遗传标记，个体间遗传物质即核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是是DNA水平遗传多态性的直接反映。水平遗传多态性的直接反映。遗传标记的共同特点：遗传标记的共同特点：多态性、易于鉴别多态性、易于鉴别.2.遗传标记种类形态学标记（morphological marker）细胞学标记(cytological marker)免疫学标记（Immune markers）生化标记(Biochemical marker)分子标记(Molecular marker)（1）形态学标记形态学标记

3、指肉眼可见的或仪器测量的动物的外部形态特征，形态学标记指肉眼可见的或仪器测量的动物的外部形态特征，如毛色、体型、外形等，是研究动物群体起源、地方品种特如毛色、体型、外形等，是研究动物群体起源、地方品种特征及品种间关系的遗传标记；征及品种间关系的遗传标记；生理遗传标记是反映动物生长发育、代谢过程等的一些标记，生理遗传标记是反映动物生长发育、代谢过程等的一些标记，如羽毛生长速度基因（家禽）、双胎（牛）、应激综合征如羽毛生长速度基因（家禽）、双胎（牛）、应激综合征（猪）。（猪）。家禽快慢羽基因家禽快慢羽基因:性染色体上的性染色体上的2个等位基因决定雏鸡羽毛生长速度的差异个等位基因决定雏鸡羽毛生长速度

4、的差异,其中隐性基因为其中隐性基因为快羽基因快羽基因k+,显性基因为显性基因为慢羽基因慢羽基因K.(1922年年,Serebrovsky)形态标记简单直观、经济方便；形态标记简单直观、经济方便；标记数量多数有限、多态性较差，表现易受标记数量多数有限、多态性较差，表现易受环境影响，并且有一些标记与不良性状连锁；环境影响，并且有一些标记与不良性状连锁；形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合等形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合等过程，周期较长；过程，周期较长；主要在早期使用。主要在早期使用。（2）细胞学标记是指动物个体细胞染色体数目和形态特征。主要包括：染是指动物个体细胞染色体数目和形态特征。主要包

5、括：染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（和带型（G带、带、C带、带、N带、带、T带等）及染色体结构变异带等）及染色体结构变异（缺失、重复、易位、倒位缺失、重复、易位、倒位）等的变化。）等的变化。细胞学标记的多态性 染色体多态性Ag-NORs（nucleolar organize regions）银染核仁组织区多态性银染核仁组织区多态性Y染色体多态性染色体多态性C带多态性带多态性 染色体变异染色体数目变异：整倍性变异、非整倍性变异染色体数目变异：整倍性变异、非整倍性变异染色体结构变异：缺失、倒位、重复、易位染色体结构变

6、异：缺失、倒位、重复、易位与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行与形态标记相比，细胞学标记的优点是能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位一些重要基因的染色体或染色体区域定位;但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长但细胞学标记材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；时间来培育，难度很大；某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异某些物种对染色体变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。难以用细胞学方法进行检测。（3）免疫学标记免疫学标记是以动物的免疫学特征为遗传标记，主要免疫学标记是以动物的免疫学特征为遗传标记，主要指：红细胞抗原、白细胞抗原、胸腺细胞抗原等。指：红细胞抗

7、原、白细胞抗原、胸腺细胞抗原等。白细胞抗原型（主要组织相容性复合体，白细胞抗原型（主要组织相容性复合体，major histocompatibility complex,MHC）:牛：牛：BoLA；猪：猪：SLA；人：人：HLA红细胞表面抗原型（血型，红细胞表面抗原型（血型，blood group）:ABO血型。血型。（4）生化标记：即血液蛋白多态标记是以动物体内的某些生化性状为遗传标记，主要指血是以动物体内的某些生化性状为遗传标记，主要指血型、血清蛋白、同工酶和同位酶等。型、血清蛋白、同工酶和同位酶等。这些蛋白质和酶，在电这些蛋白质和酶，在电场中因迁移方向和速度场中因迁移方向和速度不同而被分

8、离开来；不不同而被分离开来；不同个体在同一蛋白质或同个体在同一蛋白质或酶座位的类型并不完全酶座位的类型并不完全一样，显示出的谱带具一样，显示出的谱带具有多态性。有多态性。同工酶与同位酶同工酶(isozyme)：生物体内具有同一底物专生物体内具有同一底物专一性的不同分子形式的酶。一性的不同分子形式的酶。同位酶(allozyme)：指同一基因座的不同等位指同一基因座的不同等位基因所编码的一种酶的不同形式，基因所编码的一种酶的不同形式，其功能相其功能相同但氨基酸序列不同。同但氨基酸序列不同。由于所带电荷的差异，由于所带电荷的差异，可通过电泳分离辨别。可通过电泳分离辨别。（5）分子标记（molecul

9、ar marker）分子标记（广义）是以个体间遗传物质内核苷酸序分子标记（广义）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是列变异为基础的遗传标记，是 DNA 水平遗传多态性水平遗传多态性的直接反映。也称的直接反映。也称DNA标记（狭义）。标记（狭义）。DNA标记标记等位基因等位基因(Allele)分子标记的特点数量多，多态性丰富；多态性丰富；大多呈大多呈中性突变，不影响目标性状的表达；，不影响目标性状的表达；遗传极为稳定，不易受生理期和外界环境不易受生理期和外界环境等因素影响；等因素影响；呈呈共显性或或完全显性遗传。遗传。分子标记种类I 类标记：出现在基因内部，影响到该基因的功能，

10、进而影响性出现在基因内部，影响到该基因的功能，进而影响性状表现的分子标记。状表现的分子标记。II 类标记：在基因外部，与基因功能无关的分子标记，也称为匿在基因外部，与基因功能无关的分子标记，也称为匿名标记（名标记（anonymous marker）。如微卫星）。如微卫星DNA标记。标记。常见的分子标记 限制性片段长度多态性(Restricted fragment length polymorphisms,RFLP)随机扩增多态DNA（Random amplified polymorphism DNA,RAPD）扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymo

11、rphism,AFLP）单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms,SNPs）DNA指纹（DNA fingerprint）微卫星DNA（microsatellite DNA）线粒体DNA（mitochondria DNA，mtDNA）限制性片段长度多态性（RFLP）限制性内切酶可识别基因组内某些特异限制性内切酶可识别基因组内某些特异DNA序列，并序列，并在此处催化裂解，产生一系列大小不等的在此处催化裂解，产生一系列大小不等的DNA片段片段;经琼脂糖凝胶电泳，转移到硝酸纤维素膜上，用已标经琼脂糖凝胶电泳，转移到硝酸纤维素膜上，用已标记过的特异性探针杂交记过的特

12、异性探针杂交;通过放射自显影检测出特定通过放射自显影检测出特定DNA片段的差异。片段的差异。NoteNote:纯合子与杂合子的区分纯合子与杂合子的区分PCR-RFLP结果示意图结果示意图Note Note:纯合子与杂合子的区分纯合子与杂合子的区分RFLP标记原理：特定识别序列碱特定识别序列碱基改变基改变,造成酶切位造成酶切位点缺失或产生；点缺失或产生；目标区域内片段目标区域内片段的插入或缺失，导的插入或缺失，导致酶切片段长度的致酶切片段长度的改变。改变。例子例子:猪猪 ESR(雌激素受体雌激素受体)基因基因 ESR 基因：具有基因：具有A 和和 B两个等位基因两个等位基因 BB 型猪具有更高的

13、窝产仔数型猪具有更高的窝产仔数 AA 型猪窝产仔数低于型猪窝产仔数低于 BB型猪型猪猪ESR 基因型检测AA:4.3kbAB:4.3kb,3.7kb,0.6kbBB:3.7kb,0.6kb RFLP标记的特点遍布于遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；，数量几乎是无限的；结果结果稳定、可靠；呈呈共显性遗传，可区分纯合子和杂合子；，可区分纯合子和杂合子；大多数大多数无表型效应，不受选择的影响。，不受选择的影响。随机扩增多态 DNA（RAPD）由由Williams等于等于1990年提出的一种检测年提出的一种检测DNA多态性的多态性的方法方法,利用一系列随机排列碱基顺序的寡核苷酸单链利用一系列随机排列

14、碱基顺序的寡核苷酸单链(10或或11bp)作为引物作为引物(随机引物随机引物)，对基因组，对基因组DNA进行进行扩增，随机获得大小不同的扩增，随机获得大小不同的DNA片段片段;扩增产物通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，扩增产物通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再经溴化乙锭或银染检测扩增再经溴化乙锭或银染检测扩增DNA片段的多态性。片段的多态性。RAPD标记原理：与引物互补的位置发生碱基突变，导致引物与引物互补的位置发生碱基突变，导致引物结合位点的分布发生变化；结合位点的分布发生变化；引物可扩增区域内引物可扩增区域内DNA序列的插入或缺失，序列的插入或缺失，导致扩增片段大小发生改变。

15、导致扩增片段大小发生改变。RAPD 电泳结果示意图RAPD多态性主要来多态性主要来自：自：与引物互补的位置与引物互补的位置发生碱基突变；发生碱基突变；引物可扩增区域内引物可扩增区域内DNA序列的插入或缺序列的插入或缺失。失。由于该方法中所用引物的碱基排列是随机的，引物可由于该方法中所用引物的碱基排列是随机的，引物可达成百上千，故所检测到的是生物体的整个基因组。达成百上千，故所检测到的是生物体的整个基因组。但但RAPD标记具有标记具有3 个主要缺点：一是一是RAPD 标记中的一条染色带往往是一种标记中的一条染色带往往是一种混合标记，是在基因组，是在基因组DNA中扩增位点不一、长度相同或相中扩增位

16、点不一、长度相同或相近的一组近的一组DNA片段的混合物片段的混合物;二是二是RAPD标记标记呈显性遗传，不能区分纯合子和杂，不能区分纯合子和杂合子合子;三是该方法的三是该方法的稳定性和重复性较差。DNA指纹（DNA fingerprint）通过用限制性内切酶消化基因组取得不同大小的通过用限制性内切酶消化基因组取得不同大小的DNA片段，然后与特异的核心探针杂交经放射自显影可得片段，然后与特异的核心探针杂交经放射自显影可得到一系列类似手指指纹的谱带，称为到一系列类似手指指纹的谱带，称为DNA指纹图谱。指纹图谱。两个无亲缘关系的个体在同一位置上共有相同区带图两个无亲缘关系的个体在同一位置上共有相同区

17、带图谱的机率极低，所以谱的机率极低，所以DNA指纹图被认为是某一个体独指纹图被认为是某一个体独有的。这种技术已广泛地应用于法医和亲子鉴定。有的。这种技术已广泛地应用于法医和亲子鉴定。DNA fingerprintDNA指纹产生的原因 卫星DNA（satellite DNA）小卫星DNA（minisatellite DNA）卫星卫星DNA在同一物种不同个体间数目不同，核心序列在同一物种不同个体间数目不同，核心序列重复次数也存在差异。重复次数也存在差异。同一物种不同个体基因组中的小卫星数目不同，小卫同一物种不同个体基因组中的小卫星数目不同，小卫星核心重复序列数目也不同，所得星核心重复序列数目也不同

18、，所得DNA指纹图谱不指纹图谱不一样一样。小卫星小卫星DNA的检测的检测小卫星种小卫星种类和数目类和数目不同导致不同导致的多态的多态 微卫星DNA（microsatellite DNA）又称简单重复序列（又称简单重复序列（simple sequence repeats,SSRs）、）、短串连重复序列（短串连重复序列（short tandem repeats,STRs）。以）。以2-6个短核苷酸序列（核心序列）为基本单位（常见个短核苷酸序列（核心序列）为基本单位（常见CA重复），呈串连重复状散在分布于生物体整个基重复），呈串连重复状散在分布于生物体整个基因组中因组中。微卫星多态性个体1：(CA)

19、12个体2：(CA)8微卫星微卫星DNA标记的特点标记的特点分布广泛:广泛分布于真核生物基因组的任何区域广泛分布于真核生物基因组的任何区域高度多态:多为复等位基因多为复等位基因 基因型检测方法简便：聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）引物的通用性:微卫星侧翼序列的保守性以及物种微卫星侧翼序列的保守性以及物种 间某些染色体区段的共线性，使得从一个物种获得的间某些染色体区段的共线性，使得从一个物种获得的引物可以应用于相关的分类群引物可以应用于相关的分类群 呈共显性遗传:能很好地区分纯合子与杂合子能很好地区分纯合子与杂合子是中性标记:多数情况下，微卫星标记没有任何表多数情况下，微卫星标记

20、没有任何表型效应，因而多态性能随着自然选择而保留下来型效应，因而多态性能随着自然选择而保留下来 微卫星DNA的检测聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）检测单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）指基因组指基因组DNA序列中单个核甘酸突变所引起的多态。序列中单个核甘酸突变所引起的多态。多是双等位基因，且多是双等位基因，且最小等位基因频率最小等位基因频率（minor allele frequency,MAF）在群体内不低于在群体内不低于1%。数量多，分布于整个基因组分布于整个基因组;大多表现为大多表现为二等位基因（bialletic）多态性）多态性;呈呈共显性遗

21、传，可区分纯合子和杂合子；，可区分纯合子和杂合子；分析结果分析结果稳定性和重复性好；检测方法简单。SNP的检测方法单链构象多态性（单链构象多态性（single strand conformational polymorphism，SSCP）凝胶）凝胶电泳：未知电泳：未知SNP；PCR-RFLP：已知：已知SNP的基因分型；的基因分型；DNA芯片技术：大规模已知芯片技术：大规模已知SNP基因分型；基因分型；直接测序法：未知直接测序法：未知SNP。基因型（genotype）：二倍体生物，除了性染色体二倍体生物，除了性染色体外，每个染色体都有两份，个体所拥有的一对等位外，每个染色体都有两份，个体所拥

22、有的一对等位基因的类型称作基因型，即等位基因的组合方式。基因的类型称作基因型，即等位基因的组合方式。例如一个例如一个SNP（A/G），则个体在该位点的基因型），则个体在该位点的基因型为：为：鉴定某个体的基因型，被称为鉴定某个体的基因型，被称为基因分型（genotyping）SNP的单倍型单倍型（haplotype）：）：也叫单体型，指位于也叫单体型，指位于染色体上某一区域的所有染色体上某一区域的所有SNP等位基因的集等位基因的集合。合。单倍型的理论数量：有单倍型的理论数量：有n个个SNPs，就有，就有2n个个单倍型。单倍型。但由于但由于连锁不平衡（linkage disequilibrium,

23、LD）的存在，相邻的存在，相邻SNP的等位位点倾向于以的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代。因此，一条染色体上一个整体遗传给后代。因此，一条染色体上某一区域实际上只有少数几个单倍型。某一区域实际上只有少数几个单倍型。连锁不平衡：指在某一群体中，同一条染色指在某一群体中，同一条染色体不同座位上某两个等位基因同时遗传的概体不同座位上某两个等位基因同时遗传的概率明显高于预期的随机遗传的概率的现象。率明显高于预期的随机遗传的概率的现象。由于LD的存在，实际上只存在少数几个常见的单倍型：标签SNPs（haplotype tag SNPs,htSNPs）线粒体DNA（mtDNA)多态性动物体内除了核基因组

24、外唯一存在的核外动物体内除了核基因组外唯一存在的核外DNA。由于线粒体基因组序列变异快，具有高度多态由于线粒体基因组序列变异快，具有高度多态性，因此可以作为分子标记，用于亲缘关系的性，因此可以作为分子标记，用于亲缘关系的判定和生物进化分析等。判定和生物进化分析等。二.遗传标记的应用群体遗传变异与进化研究;亲缘关系的判定；高精度遗传图谱的构建；分子标记辅助选择1.群体遗传变异与进化研究遗传多样性（genetic diversity）：）：一般指品种一般指品种间及品种内个体在间及品种内个体在DNA水平上的差异。水平上的差异。通过对遗传多样性的评估，可以了解品种的遗通过对遗传多样性的评估，可以了解品

25、种的遗传结构及遗传关系，探讨品种濒危的原因和现传结构及遗传关系，探讨品种濒危的原因和现状，从而提出合理的保护措施。状，从而提出合理的保护措施。Hi,We have close relationship.Why?we are in same province.No!We have really closerelationship.The result of microsatellites tell us!中国地方猪遗传进化关系（微卫星DNA标记）中国地方猪mt-DNA 序列测定分析2.亲缘关系的判定在育种中，常利用畜群系谱，借助亲属信息来确定个体在育种中，常利用畜群系谱，借助亲属信息来确定个体的

26、选留，因此系谱的准确程度是非常重要的；但在某些的选留，因此系谱的准确程度是非常重要的；但在某些情况下（如寄养、母畜复配、错领）不能准确判断该个情况下（如寄养、母畜复配、错领）不能准确判断该个体的亲代。体的亲代。微卫星微卫星DNA呈呈共显性遗传共显性遗传，亲代等位基因可在后代基因，亲代等位基因可在后代基因座位上搜寻到，反之由后代基因型又能够追溯到亲代等座位上搜寻到，反之由后代基因型又能够追溯到亲代等位基因。位基因。3.高精度遗传连锁图谱的构建与QTL定位QTL（quantitative trait locus）：）：数量性状数量性状基因座。指控制数量性状的基因在基因组中基因座。指控制数量性状的基

27、因在基因组中的位置，常常指一段染色体区域。的位置，常常指一段染色体区域。在育种中借助与在育种中借助与QTL连锁的分子标记，可以连锁的分子标记，可以对有关对有关QTL的遗传进行追踪，提高对数量性的遗传进行追踪，提高对数量性状优良基因选择的准确性和预见性。状优良基因选择的准确性和预见性。QTL定位（QTL mapping）是采用类似于单基因定位的方法，将是采用类似于单基因定位的方法，将QTL定位定位在遗传图谱上，确定在遗传图谱上，确定QTL与遗传标记间的距离。与遗传标记间的距离。原理：当某一遗传标记与控制数量性状的基因当某一遗传标记与控制数量性状的基因位点位于同一条染色体上且紧密连锁时，当遗位点位

28、于同一条染色体上且紧密连锁时，当遗传标记的密度足够大时，可通过性状关联分析传标记的密度足够大时，可通过性状关联分析检测出该遗传标记，从而对检测出该遗传标记，从而对QTL进行定位。进行定位。高精度遗传连锁图谱的构建是QTL定位的前提绘制高精度家畜遗传连锁图谱可以揭示家畜所携带遗绘制高精度家畜遗传连锁图谱可以揭示家畜所携带遗传信息的全部内容，从而准确确定数量性状基因座传信息的全部内容，从而准确确定数量性状基因座（QTL）在基因组中的位置。）在基因组中的位置。构建连锁图谱的构建连锁图谱的基本思路是，以微卫星是，以微卫星DNA为基础，为基础，在基因组中每隔一定距离寻找一个多态分子标记，当在基因组中每隔

29、一定距离寻找一个多态分子标记，当这些标记密度足够大并覆盖全部基因组时，可由此绘这些标记密度足够大并覆盖全部基因组时，可由此绘制一个高精度的遗传连锁图谱。制一个高精度的遗传连锁图谱。猪遗传连锁图谱的构建猪遗传连锁图谱的构建猪猪15号染色体影响肉质性状的号染色体影响肉质性状的QTL定位结果定位结果4.标记辅助选择（marker assisted selection,MAS）MAS:利用与目标性状基因（或利用与目标性状基因（或QTL）紧密连锁的）紧密连锁的分子标记，通过对分子标记进行基因型选择，从而分子标记，通过对分子标记进行基因型选择，从而实现对目标性状间接选择的一种现代育种方法。实现对目标性状间

30、接选择的一种现代育种方法。实施MAS应具备的主要条件：（1）构建高精度的遗传连锁图谱，并进行目标基因）构建高精度的遗传连锁图谱，并进行目标基因的定位的定位;（2）获得与目标基因紧密连锁的分子标记）获得与目标基因紧密连锁的分子标记;（3）简便快捷的标记检测方法。）简便快捷的标记检测方法。可利用的分子标记的种类（1）直接标记标记本身就是功能突变（标记本身就是功能突变（causative mutation）位）位点，其多态直接决定性状的表达，如氟烷基因。点，其多态直接决定性状的表达，如氟烷基因。（2）高度紧密连锁标记标记与功能突变位点处于群体范围的连锁不平衡标记与功能突变位点处于群体范围的连锁不平衡

31、状态，即它们之间几乎不发生重组，他们与功能状态，即它们之间几乎不发生重组，他们与功能突变位点的连锁相在不同家系中基本相同。突变位点的连锁相在不同家系中基本相同。（1）克服性状表型鉴定的困难：有些表型性有些表型性状难以测定，如瘦肉率。状难以测定，如瘦肉率。（2）允许早期选择：如产仔数、产奶量性状。如产仔数、产奶量性状。（3）可进行性状非破坏性评价和选择：很多很多性状是在个体成熟前进行评价，或需要屠宰后性状是在个体成熟前进行评价，或需要屠宰后才能测定（如肌内脂肪才能测定（如肌内脂肪IMF）。）。（4）可加快育种进程，提供育种效率RYR1 应激综合征，肉质应激综合征，肉质RN(PRKAG3)肉质肉质

32、(“acid meat”)ESR,FSHB 产仔数产仔数CAST 肉质肉质FUT1 仔猪腹泻和水肿病仔猪腹泻和水肿病KIT 毛色毛色(dominant white)MC1R 毛色毛色(red/black)MC4R 采食量采食量,生长生长,肉质肉质PT1 食欲食欲影响猪经济性状的候选基因 1999 R&D 100 award2002 R&D 100 award Pig industry in future!本章重点内容n 遗传标记的概念、特点和种类遗传标记的概念、特点和种类n 分子标记的主要种类、检测原理分子标记的主要种类、检测原理n 分子标记在动物遗传育种中的应用分子标记在动物遗传育种中的应用