反胶团萃取课件.ppt

1、1反胶团萃取反胶团萃取1基本术语2基本性质3反胶束的溶解作用4 反胶团萃取的影响因素5 反胶团萃取操作6 反胶团萃取特点7 反胶团萃取的应用和进展8 反胶团萃取质粒DNA示例21 1基本术语基本术语胶束胶束(micelles):向水中加入S，水溶液的随S增大而下降。当S达到一定值后，S缔合形成水溶性胶束,溶液的表面张力不再随表面活性剂浓度的增大而降低。胶团形成均是S分子自聚集的结果，是热力学稳定体系。临界胶束浓度临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC):S在水溶剂中形成胶束的最低浓度。反胶团（反胶束反胶团（反胶束reversed micelles):

2、是表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中，当浓度超过临界胶束浓度后，自发形成的一种亲水极性头朝内、疏水长链尾朝外的纳米级聚集体，其极性内核可增溶少量水，形成微“水池”（water pool).反胶束的形态：反胶束的形态：球形或近似球形，也呈柱状。极性核极性核(polar core):S分子的自组装在反胶团内形成了极性核。微水相或微水相或“水池水池”(water pool)：反胶束内溶解的水。3bac 表面活性剂分子溶于表面活性剂分子溶于非极性非极性有机溶剂中自发形成的极性有机溶剂中自发形成的极性头向内，非极性尾朝外，含头向内，非极性尾朝外，含有水分子内核有水分子内核的纳米级聚集的纳米级聚集体体 42

3、 2基本性质基本性质内水池直径内水池直径d：反胶束的大小与溶剂和S的种类与浓度、温度、I等因素有关，一般为520nm，d用下式计算：W0-有机相中水与S的摩尔比，又称为含水率(water content)；M-水的相对分子质量；asurf-界面处一个S的面积；N-阿弗加德罗常数。AOT反胶团直径反胶团直径dAOT:常用于制备反胶束的S是二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸钠,商品名为Aerosol OT,即AOT。其在异辛烷中形成反胶团dAOT:第1项为水核直径，第二项(2*1.2 nm)为二倍AOT分子长度.一般反胶团的W0不超过40.因此,依据上式,利用ATO形成的水核直径一般不超过12nm,

4、大致可容纳一个直径为510nm的pro分子.当pro分子比与反胶团直径相比大得多时(如,当M 100200kD),难于溶解到反胶团中。内水的性质：内水的性质：当W0较低(如S=AOT,W0=68)时,微水相的水分子受S亲水基团的强烈束缚,表观粘度上升50倍,疏水性也极高。随W0的增大,这些现象逐渐减弱,当 W016时,微水相的水与正常的水接近,反胶团内可形成双电层。但即使当W0值很大,水池内水的理化性质也不能与正常的水完全相同,特别是在接近S亲水头的区域内。53 3反胶束的溶解作用反胶束的溶解作用反胶束的溶解作用：反胶束的溶解作用：当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他

5、亲水物质能够通过螯合作用进入此“水池”，生物物质（蛋白质，核酸）不与有机溶剂直接接触。由于周围水层和极性基团的保护，保持了生物物质的天然构型，不会造成失活，从而实现生物物质的溶解与分离。蛋白质溶解模型：蛋白质溶解模型：a a、水壳模型：、水壳模型：蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反胶团壁隔开；b b、半岛模型：、半岛模型：pro表面存在强烈疏水区，该区直接与有机相接触；c c、pro吸附于反胶团内壁；d d、pro疏水区与几个反胶团的S疏水尾发生相互作用，被几个小反胶团所“溶解”。6溶解推动力溶解推动力A A 静电作用静电作用：当溶质所带电荷与表面活性剂相反时,由于静电引力的作用,溶

6、质易溶于反胶团,溶解率或分配系数较大,反之,则不能溶解到反胶团相中.B B 空间相互作用空间相互作用 盐浓度增大对反胶团相产生脱水效应,含水率W0随盐浓度的增大而降低,反胶团直径减小,空间排阻作用增大,pro溶解下降.C C 疏水性相互作用疏水性相互作用 氨基酸的疏水性各不相同,研究表明,除pH和I外,氨基酸或肽的m随aa疏水性的增大而增大。蛋白质的疏水性影响其在反胶团中的溶解形式,因而影响其分配系数.疏水性较大的pro可能以“半岛式”形式溶解D D 分配系数分配系数m(or K):74 4萃取的影响因素萃取的影响因素1)、pH value 若水相的若水相的pHpH小于蛋小于蛋白质的白质的pI

7、pI，蛋白质，蛋白质由于静电引力进入由于静电引力进入反胶团而萃取；当反胶团而萃取；当pHpH大于大于pIpI时，由于时，由于静电斥力溶入反胶静电斥力溶入反胶团的蛋白质脱出团的蛋白质脱出。84 4萃取的影响因素萃取的影响因素2)、盐浓度、盐浓度盐浓度盐浓度W0S&Pro Z选择性选择性盐浓度增大，静电引力减小，Pro的溶解度减小；盐浓度增大，表面活性剂极性头间的斥力减小，反胶团变小。94 4反胶团萃取的影响因素反胶团萃取的影响因素3)、盐离子的种类、盐离子的种类K+Ca2+Na+Mg2+104 4 萃取的影响因素萃取的影响因素4)、蛋白质分子量、蛋白质分子量M114 4萃取的影响因素萃取的影响因

8、素5)、表面活性剂、表面活性剂A种类种类1)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；2)三辛基甲基氯化铵(TOMAC)；3)双十六烷基二甲基溴化铵(2C16QA)4)丁二酸-2-乙基己基酯磺酸钠(AOT)B浓度浓度125 5反胶束萃取的操作反胶束萃取的操作A 萃取的基本方法萃取的基本方法B 反萃取反萃取 .C 分级萃取分级萃取13 图中左侧单元进行反胶团萃取，经沉降澄清器后反胶团相进入右侧单元的混合器进行反萃，从反萃的沉降澄清器中流出的反胶团相循环返回左侧萃取混合器，从而实现连续萃取分离操作。146 6反胶团萃取的特点反胶团萃取的特点与其他分离技术相比，反胶团萃取具有如下特点：很高的萃取率和选择性很

9、高的萃取率和选择性 分离浓缩可同时进行分离浓缩可同时进行 解决蛋白质、胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题解决蛋白质、胞内酶在非细胞环境中迅速失活问题 操作方便，条件温和，处理量大，易于放大操作方便，条件温和，处理量大，易于放大 设备简单，成本低，反胶团可循环使用设备简单，成本低，反胶团可循环使用 反胶团可作为微型反应器反胶团可作为微型反应器157 应用应用生物活性物质分离生物活性物质分离Goklen等人已经成功地通过控制pH和KCl浓度，实现了核糖核酸酶a、细胞色素c、和溶菌酶的分离16 程世贤等用（AOT)-正已烷-氯化钾组成的反胶团体系从大豆中萃取蛋白质和豆油结果表明：大豆蛋白质的萃取率最高

10、达96.9%，豆油的萃取率为90.5%。Rahaman 等采用浓度250 mol/m3 的AOT/异辛烷反胶束溶液，从全发酵液中提取和提纯碱性蛋白酶，通过优化工艺过程，酶的提取率可达50%。Giovenco 等报道用反胶束萃取方法从全料液提取和纯化棕色固氮菌的胞内脱氢酶。在反胶束的表面活性剂作用下，菌体细胞先被溶裂,析出的酶进入反胶束中，再通过选取适当的反萃取液，回收高浓度的活性酶。7 应用应用生物活性物质分离生物活性物质分离177 应用应用 酶的固定化酶的固定化酶通过一定方法固定在反胶束中,酶系统可以反复使用,而且反胶束对酶形成保护作用,使其与有机溶剂分隔而保持活性。目前反胶束酶系统的应用主

11、要有以下几方面:a)油脂的水解和合成油脂的水解和合成脂酶仅能催化油水界面上的脂肪分子,对纯样脂肪体系无能为力,利用反胶束就可以解决这个问题,反胶束中的脂酶可催化脂肪的合成或分解。b)肽和氨基酸的合成肽和氨基酸的合成反胶束酶催化合成肽的优点是能够溶解非极性和极性的底物c)有害物质的降解有害物质的降解 Crecchio等将这种酶成功固定于反胶束中,用于水中的芳香族化合物的解毒,反应产物是水不溶性的,易于分离。18197 反胶束萃取技术研究新进展反胶束萃取技术研究新进展 新型反胶团体系的研制新型反胶团体系的研制 将传统的单一表面活性剂改为两种或两种以上表面活性剂混合,称为混合反胶团体系,可得到W 0

12、大的反胶团,满足相对分子质量较大的蛋白质的萃取。加入具有亲和作用的配体,称为亲和反胶团体系 开发合适的助表面活性剂。蛋白质反萃取方法的改进以及反胶束萃取的工业化模蛋白质反萃取方法的改进以及反胶束萃取的工业化模拟也成为近年来的研究热点。拟也成为近年来的研究热点。对于反胶束酶系统的研究对于反胶束酶系统的研究,主要集中于反胶束中酶的定主要集中于反胶束中酶的定位和结构、酶催化的动力学特征、酶的催化活性及稳位和结构、酶催化的动力学特征、酶的催化活性及稳定性等方面。定性等方面。208 反胶团萃取基因治疗质粒反胶团萃取基因治疗质粒DNA传统的分离方法传统的分离方法易引起生物产品的变性和失活易引起生物产品的变

13、性和失活层析技术层析技术选择性差，耗时较长等不足选择性差，耗时较长等不足反胶团萃取反胶团萃取成本低，选择性高，萃取过程简单成本低，选择性高，萃取过程简单基因治疗基因治疗DNADNA质质粒的提取方法粒的提取方法黄翠云，许陈云，焦懿，何正等 21人类基因组计划人类基因组计划(HGP)(HGP)基因治疗基因治疗 是指将DNA自身作为高效生物物质利用的一项医学技术。22基因治疗的方法基因治疗的方法 基因基因+载体载体Cell culture离体转移离体转移（ex vivo）活体直接转移活体直接转移(in vivo)23基因治疗的载体基因治疗的载体病毒载体病毒载体(70%):反转录病毒载体反转录病毒载体

14、腺病毒载体腺病毒载体腺相关病毒载体腺相关病毒载体疱疹疱疹病毒病毒非病毒载体非病毒载体(30%):裸质粒裸质粒DNA 脂质体脂质体 阳离子多聚物阳离子多聚物 24聚焦非病毒载体聚焦非病毒载体适合适合工业生产工业生产易于组装易于组装稳定性稳定性良好良好低毒低毒性质性质逆转录逆转录病毒病毒腺病毒腺病毒腺病毒伴腺病毒伴随病毒随病毒非病毒非病毒载体载体最大外源基最大外源基因容纳量因容纳量8 kbp30 kbp4.5 kbp无限无限基因转移基因转移体外体外体外体外/内内体外体外/内内体外体外/内内安全性安全性基因变基因变异异免疫反应免疫反应免疫反应免疫反应无无稳定性稳定性差差一般一般差差好好 随着人类对疾

15、病发随着人类对疾病发病分子机制的深入研究病分子机制的深入研究及人类基因组计划的实及人类基因组计划的实施，施，非病毒载体非病毒载体，主要，主要包括质粒脂质体和裸包括质粒脂质体和裸质质粒粒DNADNA,正在成为最有正在成为最有吸引力的基因传递载体。吸引力的基因传递载体。实验采用质粒实验采用质粒：pPhyt148 10.6 kbpUK21CMV 1.2 7.6 kb25 质粒质粒DNA的拓扑异构体结构的拓扑异构体结构标准认可的规格分析方法质粒均一度 90-95%ccc形式凝胶和毛细管电泳蛋白质测不出BCA方法RNA测不出凝胶电泳基因组DNA 50 g mg-1 DNAPCR,Southern-Blo

16、t内毒素 100 E.U.mg-1 DNA生物学活性和鉴别与限制性内切酶图谱一致的片断限制性核酸内切酶和凝胶电泳无菌度21天测不出克隆TB-琼脂培养基培养转化效率与治理标准品一致表达强度转染试验27反胶团萃取的特点反胶团萃取的特点分离速度快，具有提纯和浓缩作用分离速度快，具有提纯和浓缩作用2分离料液处理简单，操作方便分离料液处理简单，操作方便 4选择性好、分离效率高选择性好、分离效率高 3 1分离条件温和，能使生物物质保持较高的活性收率分离条件温和，能使生物物质保持较高的活性收率 3 3易放大，正萃和反萃同时进行易放大，正萃和反萃同时进行529实验方法实验方法l 培养基、溶液及分析试剂的配制培

17、养基、溶液及分析试剂的配制l 质粒质粒DNA的粗提的粗提 SDS碱裂解法大量制备质粒DNAl 大肠杆菌大肠杆菌RNA的提取的提取 RNA out 法反胶团萃取溶液的制备反胶团萃取溶液的制备n凝胶电泳凝胶电泳反胶团萃取溶液的制备反胶团萃取溶液的制备核酸水溶液的制备核酸水溶液的制备n核酸测定核酸测定反胶团萃取溶液的制备反胶团萃取溶液的制备 称 取 一 定 质 量 的 表 面 活 性 剂称 取 一 定 质 量 的 表 面 活 性 剂TOMAC(三辛基甲基氯化铵三辛基甲基氯化铵)或或 2C16QA(双十六烷基二甲基溴化铵双十六烷基二甲基溴化铵)，溶于一定体积比例的异辛烷溶于一定体积比例的异辛烷/正戊醇

18、正戊醇混合有机溶剂中，配成一定浓度的混合有机溶剂中，配成一定浓度的 透明澄清的反胶团溶液：透明澄清的反胶团溶液：TOMAC溶溶于于 1 （v/v）正 戊 醇）正 戊 醇/异 辛 烷；异 辛 烷；2C16QA溶于溶于5（v/v）正戊醇）正戊醇/异辛异辛烷。烷。31 将核酸溶于一定pH值的10 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液中构成初始水相，用NaCl，KCl，CaCl2，KBr或KNO3调节离子强度。质粒DNA浓度为50 g/ml，RNA浓度为25 g/ml。32 取一定体积比的反胶团相和水相置于离心管中，150 rpm下振荡2 h，萃取完成后，8000 rpm离心5 min，以使混合物分

19、相，用移液枪小心将两相分开，用于各种分析。33 核酸（质粒DNA，RNA）的萃取率E定义为萃入有机相的核酸浓度和初始水相的核酸浓度的比值：E=Corgeq/Caqinit 100%=（CaqinitCaqeq/Caqinit 100%35 核酸的反萃取率E定义为反萃入另一水相的核酸浓度和正向萃取平衡时的有机相核酸浓度的比值：E=Caqeq/Corgeq =Caqeq/（CaqinitCaqeq）36表面活性表面活性剂浓度剂浓度萃取时间萃取时间初始浓度初始浓度离子强度离子强度 反胶束萃取反胶束萃取萃取温度萃取温度 pHpH值值对反胶团萃取的考察因素对反胶团萃取的考察因素374251 10011

20、0010 1010 1101 0001 0100 101138表面活性剂种类和浓度对质粒表面活性剂种类和浓度对质粒DNA萃取率萃取率的影响的影响020406080100405060708090100 Extraction ratio of pCMV,E/%Surfactant concentration,C/mmol L-1 CTAB TOMAC 2C16QA020406080100405060708090100 Extraction ration of pPhyt148,E/%Surfactant concentraction,C/mmol L-1 CTAB TOMAC 2C16QA对质粒对

21、质粒pUK21CMV 1.2萃取率的影响萃取率的影响 对质粒对质粒pPhyt148萃萃取率的影响取率的影响39萃取时间对质粒萃取时间对质粒DNA萃取率的影响萃取率的影响 05010015020025060708090100 Extraction ratio of plasmid DNA,E/%Extraction time,t/min TOMAC/pCMV TOMAC/pPhyt148 2C16QA/pCMV 2C16QA/pPhyt148 萃取时间1.5 h左右，四种反胶团体系对质粒的萃取率均已在93%以上40水相水相pH值对质粒值对质粒DNA萃取率的影响萃取率的影响246810304050

22、60708090100 Extraction ratio of plasmid DNA,E/%Extraction pH TOMAC/pCMV TOMAC/pPhyt148 2C16QA/pCMV 2C16QA/pPhyt14841阳离子种类和浓度对质粒阳离子种类和浓度对质粒DNA萃取率的影响萃取率的影响 0100200300400020406080100 Extraction ratio of pCMV,E/%Concentraction of cation,C/mmol L-1NaK Ca2对质粒对质粒pUK21CMV 1.2萃取率的影响萃取率的影响01002003004000204060

23、80100 Extraction ratio of pPhyt148,E/%Concentraction of cation,C/mmol L-1 NaK Ca2对质粒对质粒pPhyt148萃萃取率的影响取率的影响不同不同NaCl浓度下浓度下 不同不同CaCl2浓度下浓度下 43阴离子种类和浓度对质粒阴离子种类和浓度对质粒DNA萃取率的影响萃取率的影响 对质粒对质粒pUK21CMV 1.2萃取率的影响萃取率的影响对质粒对质粒pPhyt148萃萃取率的影响取率的影响0100200300400020406080100 Cl BrNO3 Extraction ratio of pCMV,E/%Con

24、centration of anion,C/mmol L-10100200300400020406080100 Extraction ratio of pPhyt148,E/%Concentration of anion,C/mmol L-1 Cl Br NO344不同不同KBr浓度下浓度下pUK21CMV 1.2萃余水萃余水相的电泳图相的电泳图 45其它因素对萃取的影响其它因素对萃取的影响 20304050607080901009092949698100 pCMV pPhyt148 Extraction ratio of plasmid DNA,E/%DNA concentration,CD

25、NA/mmol L-1212427303336395060708090100 Extraction ratio of plasmid DNA,E/%Extraction temperature,T/pCMV pPhyt148初始质粒DNA浓度温度对萃取的影响46油水相体积比对萃取的影响油水相体积比对萃取的影响 00.51.01.52.0020406080100 Extraction ratio of plasmid DNA,E/%The ratio of organic to water phase TOMAC/pCMV TOMAC/phytase 2C16QA/pCMV 2C16QA/pPh

26、yt14847反胶团萃取条件确定反胶团萃取条件确定萃取实验条件萃取实验条件反胶团浓度反胶团浓度 40 mmol/L水相水相pH 8.0（Tris-HCl）质粒浓度质粒浓度 50 g/ml 水相离子强度尽可能低水相离子强度尽可能低 (无离子无离子)萃取时间萃取时间 2h反应温度反应温度 37,转速转速150 rpm48质粒质粒DNA反向萃取的研究反向萃取的研究 由于界面性质，热力学的关系对动力学的影响还不是很清因素的改变以及各因素之间的相互依存楚，反萃并非是前萃完全意义上的可逆过程，因而增加了研究的难度。主要通过改变水相中的pH、离子种类和浓度实现DNA反萃取的条件。49050100150200

27、250300020406080100 Back-extraction ratio of DNA,E/%Extraction time,t/min pPhytase pCMV2345678405060708090pCMV pPhyt148 Back-extraction ratio of DNA,E/%pH反萃时间反萃水相pH值 对质粒对质粒pUK21CMV 1.2 对质粒对质粒pPhyt148 5102004006008001000020406080100 Na K Ca2 Back-extraction ratio of pCMV,E/%Concentration of cation,C/m

28、mol L-102004006008001000020406080100 Na KCa2 Back-extraction ratio of pPhyt148,E/%Concentration of cation,C/mmol L-1对质粒对质粒pUK21CMV 1.2对质粒对质粒pPhyt14852对质粒对质粒pUK21CMV 1.2对质粒对质粒pPhyt14802004006008001000020406080100 Back-extraction ratio of pPhyt,E/%Concentration of anion,C/mmol L-1 ClBr NO3020040060080

29、01000020406080100 Cl Br NO3 Back-extraction ratio of pCMV,E/%Concentration of anion,C/mmol L-1 对质粒对质粒pUK21CMV 1.2 对质粒对质粒pPhyt148 55水相水相pH值对值对RNA萃取和萃取和反萃取的影响反萃取的影响23456789095100 Extraction ratio of RNA,E/%pHE of RNA234567020406080 Back-extraction ratio of RNA,E/%pH E of RNA正向萃取正向萃取反向萃取反向萃取56离子种类和浓度对离

30、子种类和浓度对RNA萃取的影响萃取的影响 0100200300400020406080100 Na+K+Ca2+Extraction ratio of RNA,E/%Concentration of cation,C/mmol L-10100200300400020406080100 Cl Br NO3 Extraction ratio of RNA,E/%Concentration of anion,C/mmol L-1阳离子种类和浓度阴离子种类和浓度57离子种类和浓度对离子种类和浓度对RNA反萃取的影响反萃取的影响 0100200300400500600020406080100 Na K

31、Ca2 Back-extraction ratio of RNA,E/%Concentraction of cation,C/mmol L-10100200300400500600020406080100 Cl Br NO3 Back-extraction ratio of RNA,E/%Concentraction of anion,C/mmol L-1阳离子种类和浓度阳离子种类和浓度 58离子浓度对离子浓度对DNA和和RNA萃取影响的比较萃取影响的比较0100200300400020406080100 pCMV phytase RNA Extraction ratio,E/%Concent

32、ration of KCl,C/mmol L-10100200300400500600020406080100 Back-extraction ratio,E/%Concentraction of KNO3,C/mmol L-1 pCMV pPhytase RNAKCl萃取比较KNO3反萃比较59离子浓度对质粒离子浓度对质粒DNA和和RNA混合物萃取混合物萃取 和反萃取的影响和反萃取的影响0100200300400020406080100 Extraction ratio,E/Concentration of KCl,C/mmol L-10100200300400500600020406080

33、100 Back-extraction ratio,E/%Concentration of KCl,C/mmol L-1萃取对应电泳图60从从SDS碱裂解法质粒碱裂解法质粒DNA粗提液中粗提液中提纯质粒提纯质粒DNA反胶团重复利用提取质粒DNA示意图总收率依次为 97.13%84.70%83.76%612402602803000.00.20.40.60.81.01.21.4 AbsorbanceWavelength,nm21试剂盒质粒 DNA2反萃水相DNA1反萃水相质粒DNA的紫外光谱示意图62结论结论 v表面活性剂的种类和浓度对实现萃取至关重要。v盐离子种类和浓度对核酸的正萃和反萃都有显著影响。v萃取速度上，反萃取的速度比正萃要慢，可能是由于动力学的因素不同导致。v核酸的萃取和反萃的显著差异证明反胶团对于质粒DNA有良好的选择性。v反胶团材料可以重复利用，即节省大量原材料，又不使质粒DNA失活，并能保证较高的收率。63展望展望环保环保生物化工生物化工医疗医疗反胶团萃取反胶团萃取分离技术分离技术反胶团萃取分离技术反胶团萃取分离技术是一种新型的，有发是一种新型的，有发展前途的生物产品的展前途的生物产品的分离技术，分离技术，对保持生对保持生物活性具有相当重要物活性具有相当重要的意义的意义。