DNA甲基化检测课件.ppt

1、DNA甲基化研究 张茂雷张茂雷 2009.5.23主要内容主要内容DNA甲基化原理DNA甲基化的研究方法 甲基化的生物学作用问题与展望DNA甲基化原理甲基化原理 DNA 甲基化是指生物体在甲基化是指生物体在DNA 甲基转移酶甲基转移酶(DNA methyltransferase,DMT)的催化下的催化下,以以s-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体为甲基供体,将甲基转移到特定的碱基上的过将甲基转移到特定的碱基上的过程。程。DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的甲基化可以发生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的位、鸟嘌呤的N-7位位或胞嘧啶的或胞嘧啶的C-5位等位等在哺乳动

2、物在哺乳动物DNA甲基化主要发生在基因启动子或第一外显子甲基化主要发生在基因启动子或第一外显子中中-CG-（-CpG-）二核苷酸中的二核苷酸中的C发生甲基化变成发生甲基化变成-mCG-NNN H2OD N A 甲 基 化 酶NNN H2OC H3AHO O C C HC H2C HS C H2N H2OO H O HAHO O C C HC H2C HS C H2N H2OO H O HC H3+(S A M)DNA甲基化研究方法甲基化研究方法基因组整体水平甲基化分析 特异性位点的DNA甲基化的检测 甲基化新位点的寻找 基因组整体水平甲基化分析高效液相色谱柱（HPLC）SssI 甲基转移酶法免

3、疫化学法氯乙醛法 特异性位点的DNA甲基化的检测-亚硫酸氢盐修饰亚硫酸氢盐修饰特异性位点的DNA甲基化的检测直接测序法 Bisulfite sequencing PCR（BSP）甲基化特异性的PCR（methylation-specific PCR,MSP）结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法甲基化敏感性单核苷酸引物延伸甲基化敏感性解链曲线分析甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法（不需亚硫酸氢盐修饰亚硫酸氢盐修饰）特异性位点的DNA甲基化的检测BSP和MSP法实验举例实验举例通过BSP和MSP 方法对于前列腺癌 DLC-1基因启动子甲基化情况进行检测。实验方法及结果：1在线设计MSP

4、引物（http:/www.urogene.org/methprimer/index1.html）DNA Extraction3 DNA Bisulfite Treatment(Active Motif CO.,USA)4 Bisulfite sequencing PCR 5 Methylation-Specific PCR 1 1A结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法C甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性(不需要亚硫酸氢盐，将DNA消化为不同大小的片段后再进行分析。常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有Hpa-Msp(识别序列CCGG)

5、Rapid analysis of CpG methylation patterns using RNase T1 cleavage and MALDI-TOF甲基化新位点的寻找 限制性标记基因组扫描（RLGS）用甲基化敏感的稀频限制性内切酶Not消化基因组DNA，甲基化位点保留，标记末端、切割、行一维电泳，随后再用更高频的甲基化不敏感的内切酶切割，行二维电泳，这样甲基化的部分被切割开并在电泳时显带，得到RLGS图谱与正常对照得出缺失条带即为甲基化的可能部位 在研究中，科学家运用限制性界标基因基因组扫描技术对6号染色体区域进行 了扫描，发现了被甲基化的TCF21基因基因。这个基因基因，由于在肿

6、瘤肿瘤细胞中被甲基化，因此表现出沉默状态。甲基化的生物学作用DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。与胚胎发育：胚胎发育过程中DNA甲基化动态变化：精子和卵子是高度甲基化，受精后几个小时精子基因组发生主动去甲基化去甲基化,卵子基基因组在卵裂过程中依赖于 DNA 的复制被动地、滞后地去甲基化去甲基化,在 8-细胞细胞期甲基化甲基化水平降到最低点,紧接着在桑椹胚时又升高，女性两条XX染色体有一条是由于甲基化而全部灭活。DNA上的表观遗传(epigenetic)化学标记一生中都不断变化，并且变化程度在家庭

7、成员之间是相似的。美国医学协会期刊(JAMA)2008.6.25与体细胞重编程 密切相关多能干细胞的提取物与体细胞共孵育实验293T 细胞与多能细干胞的提取物共孵育，可使其重编程，重新去分化为多能细胞 常家的多能细胞提取物羊胎素 的作用与生物的记忆存储有密切关系人对外界事物的记忆最终是储存到基因中而不是大脑皮层（2008年PANS)与基因基因C T突变的关系突变的关系DNA 甲基化引起基因突变的机制主要是由于DMT催化反应形成。DMT可以加快C(胞嘧啶)和5mC 脱氨,封闭U(尿嘧啶)的修复,并且使U T 改变,故DMT 促使CpG序列的C T突变抑癌基因p53就是一个典型的例证。50%实体瘤

8、病人出现p53基因突变。突变中24%是CpG 甲基化后脱氨引起的CT 突变。甲基化的生物学作用与基因沉默与基因沉默 的关系基因的甲基化改变了基因的构型,影响DNA特异顺序与转录因子的结合,使基因不能转录;基因5端调控序列甲基化后与核内甲基化CG序列结合蛋白(methyl CG-binding p rotein)结合,阻止了转录因子与基因形成转录复合物;DNA去甲基化为基因的表达创造了一个良好的染色质环境，可活化基因表达体外实验：体外转染诱导因子基因使皮肤成纤维细胞转变成iPS 细胞过程中，伴随载体编码转录因子的逐渐沉默(甲基化)甲基化与肿瘤 抑癌基因的甲基化与细胞周期调控（如p16INK4a,

9、p15INK4a,Rb,p14ARF)、DNA修复(BRCA1,MGMT)、细胞凋亡(DAPK,TMS1)、抗药性、分化、血管生成与转移等相关联 问题与展望 DNA的甲基化涉及基因的“开”与“关”，与细胞的生长繁殖、凋亡、细胞的重编程及肿瘤细胞的形成密切相关。但对DNA甲基化还有许多问题没有认识清楚：怎样提高甲基化检测的灵敏与准确度？正常组织与肿瘤组织的甲基化精细“图谱”是怎样的？2003年启动 联合 基因甲基化的选择性（基因组织特异性表达、管家基因的启动子抑甲基化）甲基化的调控机理高效的甲基化治疗方法参考文献参考文献1W u C et al.Genes,Genetics,and Epigen

10、etics:A Correspondence.Science,2001,293(5532):1103-1105.2Wolff A P.Chromatin remodeling:why it is important in cancer.Oncogene,2001,20(24):2988-2990.3Pennisi E.Behind the Scenes of Gene Expression.Science,2001,293(24):1064-1067.4Robertson KD.DNA methylation,methyltransferases,and cancer.Oncogene,200

11、1,20(24):3135-3155.5Holliday R.Mutation Res,2001,483(Supp ll):s36 周玉球周玉球.DNA甲基化分析技术的研究进展甲基化分析技术的研究进展.国外医学遗传学分册国外医学遗传学分册2001,24(6):303-3087 Herman JG et al.Methylation-specific PCR:A novel PCR assay for methylation status of CpG islands。Proc Natl A cad SciU SA,1996,93:9821-9826.8Ahmad I,Rao DN.Chemistry and biology of DNA methyltransferases.Crit Rev Biochem MolBiol,1996,31:361-380.