蛋白质免疫印迹技术及常见问题优质课件.ppt

1、蛋白质免疫印迹技术及常见问题优选蛋白质免疫印迹技术及常见问题Western Blot原理简介+Western Blot一般流程+Western Blot常见问题分析内容概要内容概要 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。Western Blot 原理原理 目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析Western Blot 的应用的应用Western Blot原理简介+Western Blot一般流程+Western Blot常见问题分析内容概要内容概要Western Blot 流程流程l蛋白样品

2、的制备蛋白样品的制备SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳l转膜转膜l封闭封闭l一抗杂交一抗杂交l二抗杂交二抗杂交l底物显色底物显色蛋白样品的制备蛋白样品的制备Western blot常见问题杂交信号弱Step5：加入显色底物（或放射自显影），显色检测倒掉一抗溶液，用250ml PBS漂洗液滤膜3次，每次检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应Western blot常见问题杂交信号弱在阴极buffer中加入0.Western Blot 的应用稀盐和缓冲系统水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。更换高pH值Buffer设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有

3、非特异结合拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳Western Blot一般流程硝酸纤维素膜：80g/cm2）拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲凝胶浓度与蛋白分离范围封闭非特异性抗体结合麻烦胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。蛋白样品的定量蛋白样品的定量 不连续的电泳缓冲体系。SDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶成分凝胶成分 N,N亚甲双丙烯酰胺和丙烯酰胺 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris甘氨酸电泳缓冲液凝胶浓度

4、与蛋白分离范围凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212转膜转膜 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。转膜方法转膜方法 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。转膜后检测转膜后检测Step5：加入显色底物（或放射自显影），显色检测Western Blot一般流程检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应增加蛋

5、白上样量，做已知标准量蛋白的对照更换高pH值Buffer胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。维素滤膜，换水几次。抗体与封闭剂出现交叉反应将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤Western Blot常见问题分析蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度01%SDS 可提高转膜效率Western Blot一般流程电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温温育将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓

6、冲液中，电转45min或过夜。Western Blot常见问题分析蛋白分子量 10KD转膜后的封闭转膜后的封闭 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以膜面积以0.1ml/cm2的量加入封闭剂，摇床上平缓摇动，于室的量加入封闭剂，摇床上平缓摇动，于室温温育温温育1-2小时。倒掉缓冲液，立即加入一抗溶液与滤膜温育。小时。倒掉缓冲液，立即加入一抗溶液与滤膜温育。一抗用量也根据0.1ml/cm2来计算，室温12小时。倒掉一抗溶液，用250ml PBS漂洗液滤膜3次，每次 10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温温育

7、12小时。一抗、二抗孵育一抗、二抗孵育二抗与底物反应显色二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法碱性磷酸酶法化学发光显色法AntiHis 应用举例：用应用举例：用Western blot检测患者检测患者血清中的血清中的HIV病毒抗体病毒抗体Western Blot原理简介+Western Blot一般流程+Western Blot常见问题分析内容概要内容概要Western blot常见问题常见问题SDS-PAGE电泳电泳胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入AP和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐条带比正常的窄

8、？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适Western blot常见问题常见问题SDS-PAGE电泳电泳？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的纸片确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温Western blot常见问题常见问题转膜及抗体检测转膜及抗体

9、检测蛋白分子量 10KD蛋白的等电点=8SDS浓度不合适凝胶太厚蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜更换高pH值Buffer在阴极buffer中加入0.005-0.01%SDS 可提高转膜效率延长转膜时间Western blot常见问题常见问题蛋白转膜效率低蛋白转膜效率低膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染封闭不充分抗体与封闭剂出现交叉反应抗体浓度过高转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应杂交前检测一抗、二抗的工作浓度Western blot常见问题常见问题显色背景高显色背景高抗体保存不当抗原不充足膜的漂洗过度抗

10、体长期保存应在70，使用前做效价检测增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照减少漂洗的时间和次数Western blot常见问题常见问题杂交信号弱杂交信号弱倒掉缓冲液，立即加入一抗溶液与滤膜温育。稀盐和缓冲系统水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。Western Blot一般流程Western Blot 流程硝酸纤维素膜：80g/cm2）胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。针的Western印迹过程。Western Blot常见问题分析更换高pH值Buffer蛋白分子量 10KD通过水溶法或有机溶剂制备总蛋白不连续的电泳缓冲体系。Step1：经电泳将HIV混合抗原按分

11、子量大小分离应用举例：用Western blot检测患者对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括（生物试剂公司提供）Western Blot一般流程Step1：经电泳将HIV混合抗原按分子量大小分离Western Blot常见问题分析抗体与封闭剂出现交叉反应Western Blot一般流程Step5：加入显色底物（或放射自显影），显色检测Western Blot一般流程Western Blot常见问题分析“微笑”或“倒微笑”条带？SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳倒掉一抗溶液，用250ml PBS漂洗液滤膜3次，每次把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.硝酸纤维素膜

12、：80g/cm2）加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温温育Western Blot常见问题分析1ml/cm2的量加入封闭剂，摇床上平缓摇动，于室温温育1-2小时。增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。蛋白分子量 10KD蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤Western blot常见问题杂交信号弱不连续的电泳缓冲体系。Step1：经电泳将HIV混合抗原按分子量大小分离一抗不是唯一特异的二抗出现非特异结合制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合Western blot常见问题常见问题显现非特异性条带显现非特异性条带