霍乱弧菌实验室检测(高等教学)课件.ppt

1、霍乱弧菌的实验室检测霍乱弧菌的实验室检测1旭日 目的目的:提高检出率提高检出率,减少漏检以及误判的发减少漏检以及误判的发生生 手段手段:检测人员是否有足够的责任心检测人员是否有足够的责任心?检测试剂准备是否齐全且符合要求检测试剂准备是否齐全且符合要求?是否严格按照检测流程进行操作是否严格按照检测流程进行操作?2旭日 霍乱是由霍乱是由0101群和群和01390139群群霍乱弧菌（霍乱弧菌（V Vcholeraecholerae）引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波及范围广、危害严重的及范围广、危害严重的甲类传染病。甲类传染病。古典生物型古典生物

2、型 小川型小川型 Ogawa(AB)O1群群 稻叶型稻叶型 Inaba(AC)埃尔托生物型埃尔托生物型 彦岛型彦岛型 Hikojim(ABC)霍乱弧菌霍乱弧菌 霍乱病原菌霍乱病原菌 O139群（群（Bengal）非非O1群群 O2-O200群群 腹泻病原菌腹泻病原菌3旭日 O1O1群，群，O139O139群霍乱弧菌群霍乱弧菌 剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡 不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到20205050（重症病人达（重症病人达7070100100）pH:7.4-9.6pH:7.4

3、-9.6快速生快速生长长 WS 289-2008 WS 289-2008 霍乱诊断标准霍乱诊断标准 霍乱防治手册（霍乱防治手册（19991999年第五版）年第五版）4旭日 5旭日 病例：粪便、肛拭子、呕吐物病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前未使用抗生素之前 “健康健康”人：粪便、肛拭子人：粪便、肛拭子 其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品 监测：水样，水产品等监测：水样，水产品等一般要求在一般要求在3 3小时内小时内室温（室温（20-25 ）条件下）条件下送达实验室检测送达实验室检测 C-BC-B运输培养基（运输培养基（pH8.4pH8.4

4、）;（或文腊二氏保存液）（或文腊二氏保存液）碱性蛋白胨水碱性蛋白胨水（pH8.4-9.2）：不是最佳的，尤其：不是最佳的，尤其6 6小时内还不能进小时内还不能进行培养时，尽量采用行培养时，尽量采用 C-BC-B运输培养基。运输培养基。6旭日 以采集病人自然排除的新鲜粪便为主，水样便采取以采集病人自然排除的新鲜粪便为主，水样便采取1 13mL3mL，成形便采取，成形便采取指甲大小的粪量，亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内指甲大小的粪量，亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3 35cm5cm处处采取，采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水（采取，采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水（8

5、.8.-9.2-9.2），），同时划线分离选择性培养基（庆大四号平板），如不能在同时划线分离选择性培养基（庆大四号平板），如不能在小时内送达实验室检测的样品，应插入小时内送达实验室检测的样品，应插入Cary-BlairCary-Blair二氏半固体保存培养二氏半固体保存培养基（或文腊二氏保存液）中送检。标本与保存液比例约为基（或文腊二氏保存液）中送检。标本与保存液比例约为1515。碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择性平板（庆大四号平板，第一板）。性平板（庆大四号平板，第一板）。碱性蛋白胨水在碱性蛋白胨水在 增菌小时，沾取菌膜下表层液体，增菌小时

6、，沾取菌膜下表层液体，划线分离选择性平板（庆大四号平板，第二板），同时吸划线分离选择性平板（庆大四号平板，第二板），同时吸取取0.10.10.2 ml0.2 ml表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。碱性蛋白胨水增菌小时后划线分离选择性平板（庆大四号碱性蛋白胨水增菌小时后划线分离选择性平板（庆大四号平板，第三板）。平板，第三板）。7旭日 水体的采集一般用无菌的水体的采集一般用无菌的500ml500ml水样瓶采集相对静止的表层水水样瓶采集相对静止的表层水(深度为深度为 30cm30cm以内以内)500ml)500ml，密封加盖后于室温（，密封加盖后于室温

7、（20-25 20-25 ）3 3小时内送达实验室小时内送达实验室检测。检测。取取450ml450ml水样，用水样，用1M 1M 氢氧化钠调整至氢氧化钠调整至pH 8.4-9.2pH 8.4-9.2。然后加。然后加1010倍浓缩碱性倍浓缩碱性胨水胨水50ml50ml。再加入。再加入1%1%亚碲酸钾亚碲酸钾0.250.250.5 ml0.5 ml和和10001000单位单位/ml/ml青霉素青霉素1 ml1 ml。3737培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大四号培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大四号平板）分离培养，同时吸平板）分离培养，同时吸0.10.10.2 ml

8、0.2 ml表层培养物转种于碱性胨表层培养物转种于碱性胨水管中作二次增菌，水管中作二次增菌，3737培养培养6 68h8h再划线接种于选择性培养基（庆大再划线接种于选择性培养基（庆大四号平板）。四号平板）。8旭日通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑冰冻的水生通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑冰冻的水生动物，有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置动物，有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置涂抹采集：涂抹采集：使用无菌棉签涂抹使用无菌棉签涂抹5 5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔，直接接种到只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔，

9、直接接种到20ml20ml碱性蛋白胨水作为增菌液处理。碱性蛋白胨水作为增菌液处理。整体或局部采集：整体或局部采集：在实验室应以无菌操作将其解剖，取鳃部和肠内容物在实验室应以无菌操作将其解剖，取鳃部和肠内容物2525克剪碎后，置灭菌均克剪碎后，置灭菌均质杯或均质袋中，加入质杯或均质袋中，加入225mL225mL倍体积的碱性蛋白胨水增菌；但小贝壳类动物，倍体积的碱性蛋白胨水增菌；但小贝壳类动物，则用锤子将外壳击碎，整体放入则用锤子将外壳击碎，整体放入100ml100ml三角瓶中，加入三角瓶中，加入5-105-10倍的碱性蛋白胨倍的碱性蛋白胨水增菌；甲壳类动物除含肉质部分外，其余部分水增菌；甲壳类动

10、物除含肉质部分外，其余部分(包括鳃、肠、足、表层外包括鳃、肠、足、表层外壳等壳等)整体放入整体放入100ml100ml三角瓶中，加入三角瓶中，加入5-105-10倍的碱性蛋白胨水增菌。倍的碱性蛋白胨水增菌。接种后的接种后的碱性蛋白胨水碱性蛋白胨水3737培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大四号平板）同时吸基（庆大四号平板）同时吸0.10.10.2 ml0.2 ml表层培养物转种于表层培养物转种于10ml10ml碱性胨水管中作二次增菌，碱性胨水管中作二次增菌，3737培养培养6 68h8h再划线接种于选择性培养基再划线接种于选择性培养基（庆

11、大四号平板）。（庆大四号平板）。9旭日10旭日 （TCBSTCBS平板生长的菌落不能直挑取进行平板生长的菌落不能直挑取进行 11旭日12旭日 13旭日O1群和O139群抗原构造与血清分型 型型 别别 群特异性抗原群特异性抗原型特异性抗原型特异性抗原AO139BC 小川小川+少量少量 稻叶稻叶+彦岛彦岛+O139 +14旭日 国内商品化的霍乱检测血清国内商品化的霍乱检测血清 国外血清：日本生研，泰国国外血清：日本生研，泰国S&A血清等血清等15旭日氧化酶试验氧化酶试验1 1盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液二甲基对苯二胺水溶液 粘丝试验粘丝试验0.50.5去

12、氧胆酸钠水去氧胆酸钠水溶液溶液 16旭日 发酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、产酸不产气 能分解色氨酸 赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（+）精氨酸双水解酶（-）17旭日 针对原始样品（如病人粪便）以及初始增菌针对原始样品（如病人粪便）以及初始增菌后的菌液进行快速检测后的菌液进行快速检测 O1O1群霍乱胶体金标记快诊卡群霍乱胶体金标记快诊卡 O139O139群霍乱胶体金标记快诊卡群霍乱胶体金标记快诊卡 荧光荧光PCRPCR快速检测试剂盒快速检测试剂盒 O1O1群、群、O139O139群双色荧光检测试剂盒群双色荧光检测试剂盒 霍乱霍乱CTXCTX毒力基因荧光检测试剂盒毒力基因荧光检测试剂盒注：快速检测并不能替代常规检

13、测的进行，只注：快速检测并不能替代常规检测的进行，只是作为辅助检测的一种手段是作为辅助检测的一种手段霍乱快速检测技术的应用霍乱快速检测技术的应用18旭日19旭日 荧光荧光PCRPCR检测霍乱弧菌检测霍乱弧菌病例标本检测环境和食品调查的初筛方法O1O1群、群、O139O139群双色荧光检测试剂盒群双色荧光检测试剂盒 深圳生科源生物技术有限公司深圳生科源生物技术有限公司20旭日O1群和O139群霍乱弧菌的检验程序鉴定分型确诊报告胶体金、荧光PCR快速诊断增菌培养（碱胨水）分离培养庆大霉素、4号、TCBS琼脂标本（粪便等）玻片凝集阳性（结合菌落、菌体形态）凝集菌落或可疑菌落纯培养（营养琼脂或克氏双糖

14、培养）第二次增菌（碱胨水）初步报告10-20小时6-8小时10-20小时直接21旭日生物安全与个人防护（生物安全生物安全与个人防护（生物安全2 2级实验室操作，做好个人防护，整个培养流级实验室操作，做好个人防护，整个培养流程产生的实验培养废弃物和均应进行高压灭菌消毒）程产生的实验培养废弃物和均应进行高压灭菌消毒）培养基的配备与质量控制（是否新鲜，含量、培养基的配备与质量控制（是否新鲜，含量、PHPH值、保存条件是否达标，分值、保存条件是否达标，分离平板、血清、生化鉴定等检测试剂质量是否满足要求，是否在有效期内使离平板、血清、生化鉴定等检测试剂质量是否满足要求，是否在有效期内使用等）用等）可疑阳性结果的及时规范上送（当出现可疑阳性菌株时，要第一时间进行分可疑阳性结果的及时规范上送（当出现可疑阳性菌株时，要第一时间进行分纯并进一步对分纯物进行血清学确认，应上送分纯后的培养物而不是初始平纯并进一步对分纯物进行血清学确认，应上送分纯后的培养物而不是初始平板！）板！）做好样品的相关登记记录。做好样品的相关登记记录。22旭日