免疫学检测方法中的干扰因素及注意的问题重点课件.ppt

1、免疫学检测方法中的干免疫学检测方法中的干扰因素及注意的问题扰因素及注意的问题组员：组员：吴聪聪吴聪聪 王泽成王泽成 沈杨沈杨 包银伟包银伟 高迪高迪 吕林吕林发言人：包银伟发言人：包银伟PPT制作：吴聪聪制作：吴聪聪 背景简介背景简介 免疫学检测就是利用免疫学检测就是利用抗原和抗体高度特异性结抗原和抗体高度特异性结合合的原理而检测分析微量物质的方法。从的原理而检测分析微量物质的方法。从20世纪世纪50年代美国学者年代美国学者Berson和和Yallow发明了放射免发明了放射免疫测定技术检测胰岛素起，免疫学检测技术经历了疫测定技术检测胰岛素起，免疫学检测技术经历了从定性到定量；从常量分析到微量、

2、超微量分析；从定性到定量；从常量分析到微量、超微量分析；从手工检测到全自动化；从单个标本检测到高通量从手工检测到全自动化；从单个标本检测到高通量检测等一系列长足的进步。检测等一系列长足的进步。随着基础免疫学研究的深入和现代免疫随着基础免疫学研究的深入和现代免疫学理论的建立，使大量免疫学检测技术被不学理论的建立，使大量免疫学检测技术被不断地创新、发明；在临床疾病诊治的应用中断地创新、发明；在临床疾病诊治的应用中也不断地推陈出新。要保证实验结果的正确也不断地推陈出新。要保证实验结果的正确性和可靠性，必须对实验整个过程中各个环性和可靠性，必须对实验整个过程中各个环节中的干扰因素有比较清楚的掌握和了解

3、。节中的干扰因素有比较清楚的掌握和了解。免疫学检测免疫学检测-干扰因素干扰因素标本自身及前处理所造成的干扰因素标本自身及前处理所造成的干扰因素:类风湿因子（类风湿因子（RF）嗜异性抗体嗜异性抗体自身抗体自身抗体补体补体纤维蛋白纤维蛋白溶血或黄疸溶血或黄疸交叉反应物质交叉反应物质外源性物质外源性物质类风湿因子类风湿因子 患者体内存在的类风湿因子能显著干扰患者体内存在的类风湿因子能显著干扰许多免疫学检测方法。许多免疫学检测方法。RFRF对不同检测系统的对不同检测系统的干扰程度有所差异，影响程度并不与干扰程度有所差异，影响程度并不与RFRF的浓的浓度成正比度成正比 。目前，在临床工作中使用的免疫。目

4、前，在临床工作中使用的免疫检测试剂盒大部分均没有很好地防止检测试剂盒大部分均没有很好地防止RFRF干扰干扰的措施，国外著名公司要好于国内公司。的措施，国外著名公司要好于国内公司。嗜异性抗体嗜异性抗体 嗜异性抗体通常是指与其他种类动物的嗜异性抗体通常是指与其他种类动物的免疫球蛋白产生反应的人类抗体，具有广泛免疫球蛋白产生反应的人类抗体，具有广泛的种特异性。嗜异性抗体干扰的程度、频率的种特异性。嗜异性抗体干扰的程度、频率与患者的疾病状态、年龄、性别等无关。与患者的疾病状态、年龄、性别等无关。自身抗体自身抗体 嗜靶抗原的自身抗体，如抗甲状腺球蛋嗜靶抗原的自身抗体，如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原

5、的自身抗体，能与白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，能与靶抗原结合形成复合物，在免疫检测系统中靶抗原结合形成复合物，在免疫检测系统中均可对靶抗原的测定结果造成负性干扰。均可对靶抗原的测定结果造成负性干扰。判断嗜靶抗原的自身抗体对检测的负干判断嗜靶抗原的自身抗体对检测的负干扰，因紧密结合患者的疾病诊断、病史、其扰，因紧密结合患者的疾病诊断、病史、其他实验检查的结果综合分析。如甲亢、甲低、他实验检查的结果综合分析。如甲亢、甲低、I I型糖尿病等。型糖尿病等。补体补体 免疫检测系统中捕获抗体在向固相包被免疫检测系统中捕获抗体在向固相包被中和标记抗体的标记过程中，抗体分子发生中和标记抗体的标记过程中，抗

6、体分子发生变构而可能造成假阳性。一些公司为了增加变构而可能造成假阳性。一些公司为了增加检测的敏感性，使用链霉亲和素包被固相，检测的敏感性，使用链霉亲和素包被固相，将捕获抗体用亲和素标记，此过程也可引起将捕获抗体用亲和素标记，此过程也可引起捕获抗体的构象发生改变捕获抗体的构象发生改变 ，造成假阳性或，造成假阳性或假性升高。假性升高。纤维蛋白纤维蛋白 临床检验工作中，有时为了争取时间快速临床检验工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时或未完全凝固检测，常在血液还未开始凝固时或未完全凝固时即强行离心分离血清，此时血清中仍残留部时即强行离心分离血清，此时血清中仍残留部分纤维蛋白原，在免

7、疫检测过程中可以形成肉分纤维蛋白原，在免疫检测过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果，尤眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果，尤其是在使用其是在使用ELISAELISA检测时。检测时。溶血或黄疸溶血或黄疸 各种人为原因引起的标本溶血，导致红细各种人为原因引起的标本溶血，导致红细胞的破坏，血红蛋白以及细胞碎片和蛋白质等胞的破坏，血红蛋白以及细胞碎片和蛋白质等释放出来。溶血对免疫检测的作用不仅是游离释放出来。溶血对免疫检测的作用不仅是游离血红蛋白的影响，更多的是细胞碎片和蛋白质血红蛋白的影响，更多的是细胞碎片和蛋白质等其他溶血产物；血红蛋白具有过氧化物酶活等其他溶血产物；血红蛋白具有

8、过氧化物酶活性，在以辣根过氧化物酶为标记的性，在以辣根过氧化物酶为标记的ELISAELISA测定中，测定中，会导致非特异性显色。溶血因测定方法的不同会导致非特异性显色。溶血因测定方法的不同可导致对免疫学检测的正向或负向干扰，且影可导致对免疫学检测的正向或负向干扰，且影响大小也有所差异。响大小也有所差异。交叉反应物质交叉反应物质 待检标本中存在类地高辛、类待检标本中存在类地高辛、类AFPAFP样样物质等，是一些与检测的靶抗原有交叉反物质等，是一些与检测的靶抗原有交叉反应的物质。在用多克隆抗体测定抗原时对应的物质。在用多克隆抗体测定抗原时对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测测定结果影响不大，但在

9、用单克隆抗体测定抗原时定抗原时 ，如果交叉抗原决定簇正好是所，如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，会出用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，会出现假阳性结果。现假阳性结果。外源性物质外源性物质 外源性物质常常是由于用于免疫测定的外源性物质常常是由于用于免疫测定的血标本采集、贮存等不当所致。血标本采集、贮存等不当所致。标本受细菌污染：标本受细菌污染：因菌体中可能含有内因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，被细菌污染的标本在源性辣根过氧化物酶，被细菌污染的标本在以辣根过氧化物酶为标记的以辣根过氧化物酶为标记的 ELISAELISA测定中，测定中，可产生非特异性显色而干扰测定结果。可

10、产生非特异性显色而干扰测定结果。标本管中添加物质的影响：标本管中添加物质的影响：抗凝剂、酶抗凝剂、酶抑制剂及分离血清的分离胶等均对免疫检测有抑制剂及分离血清的分离胶等均对免疫检测有一定干扰作用。一定干扰作用。标本保存不当：标本保存不当：在冰箱中保存过久的标在冰箱中保存过久的标本，会造成假阳性；有时抗原或抗体免疫活性本，会造成假阳性；有时抗原或抗体免疫活性减弱，也会出现假阴性。减弱，也会出现假阴性。操作流程不当造成结果的改变操作流程不当造成结果的改变 对对HBV血清标志物五项指标仅抗血清标志物五项指标仅抗-HBc总抗体总抗体单阳性的血清实行了严格的复检措施，发现初、复单阳性的血清实行了严格的复检

11、措施，发现初、复检结果的符合率检结果的符合率50%。偏差如此之大是无法用实。偏差如此之大是无法用实验人员操作不当解释的。抗验人员操作不当解释的。抗-HBc总抗体采用竞争抑总抗体采用竞争抑制制ELISA法检测法检测,日常工作中无论标本多少，必然日常工作中无论标本多少，必然是先加完血清标本后再加抗是先加完血清标本后再加抗-HBc-HRP。这样，血。这样，血清中的抗清中的抗-HBc与抗与抗-HBc-HRP存在着明显的存在着明显的“不不公平竞争公平竞争”。54(57.4)43 18 12 21 3037(39.3)21 17 18 38 2019(20.2)10 12 16 56 1010(10.6)

12、6 8 15 65 5 7(7.4)6 7 13 68 2 0 6 3 10 75 0 临界值标本临界值标本A450nm 0.3 0.30.7 0.7阴性标阴性标 本数本数 放置时间放置时间 （min）加样后放置时间对检测结果的影响加样后放置时间对检测结果的影响假阳性假阳性（）（）放置时间放置时间min A450nm1.251.61.612.02.012.5 2.5 -+-+-+-+0 25 0 20 0 17 0 13 0 2 18 7 20 0 17 0 13 0 5 16 9 19 1 17 0 13 0 10 9 16 18 2 16 1 13 0 20 2 23 12 8 12 5

13、12 1 30 0 25 416 7 10 10 3 在加样放置时间改变后阴性标本在加样放置时间改变后阴性标本A450nm与与结果的关系结果的关系 放置时放置时间间min阴性标阴性标本数本数临界值标本临界值标本A 450nm假阳性假阳性(%)假阴性假阴性(%)0.30.30.70.7 0 75 10 3 6 0 0 10 74 11 3 61(1.0)0 20 75 10 3 6 0 0 30 76 9 3 6 01(1.0)40 74 11 3 61(1.0)0 加样同时加入抗加样同时加入抗-HBc-HRP放置不同时间对检放置不同时间对检测结果的影响测结果的影响操作不当交叉污染操作不当交叉污

14、染 目前的全自动加样系统，不管是一次目前的全自动加样系统，不管是一次性加样针还是永久性加样针，均难以避免样性加样针还是永久性加样针，均难以避免样本的污染问题。特别是当遇到高浓度的抗原本的污染问题。特别是当遇到高浓度的抗原或抗体，沿加样方向被污染的甚至可能不止或抗体，沿加样方向被污染的甚至可能不止1 个孔。为了排除这种污染造成的假阳性，个孔。为了排除这种污染造成的假阳性，建议当同一行建议当同一行/列上（沿加样方向）出现连列上（沿加样方向）出现连续阳性，并经复查仍为阳性时，应同时采取续阳性，并经复查仍为阳性时，应同时采取新鲜标本进行检测来加以证实。新鲜标本进行检测来加以证实。免疫检测中值得注意的问

15、题免疫检测中值得注意的问题1、钩状效应：由于待检标本中抗原浓度的、钩状效应：由于待检标本中抗原浓度的 显著升高显著升高,而致捕获抗体不足所造成的检测而致捕获抗体不足所造成的检测结果假阴性或假低测定值。这种现象可以出结果假阴性或假低测定值。这种现象可以出现在任何免疫学检测中，一步法检测更易见。现在任何免疫学检测中，一步法检测更易见。2、检测使用一种试剂盒、复检必须使用另、检测使用一种试剂盒、复检必须使用另 一种试剂盒，最好方法也不一样。一种试剂盒，最好方法也不一样。3、HBsAg、抗、抗HBs、HBeAg、抗、抗HBe的检测最后可以使用的检测最后可以使用“中和法中和法”来鉴定。来鉴定。4、抗、抗HCV的检测目前国内外的试剂盒单的检测目前国内外的试剂盒单独使用均有可能出现假阴性或假阳性，联合独使用均有可能出现假阴性或假阳性，联合使用可以减少错误结果；并可用使用可以减少错误结果；并可用RTPCR鉴定。鉴定。