核酸提取原理及方法（完整版）.pptx

1、核酸提取原理及方法核酸提取原理及方法.ppt核酸是遗传信息的载体，是最重要的核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此，核酸的提取是分子生物学实对象，因此，核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作验技术中最重要、最基本的操作 。核酸的提取核酸的提取核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为：裂解细胞去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。沉淀核酸纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质(一一)

2、DNA提取的经典方法提取的经典方法DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯仿提取法。因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。说明：回收上层水相时，一定不要接触两相的界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心管。沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。另：异丙醇、醋酸钠等。70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。TE缓冲液：10mmol/L Tris-H

3、cl1mmol/L EDTA pH 8.5或 8RNA的提取RNA提取条件较DNA要求严格，主要是因为临床标本及实验室环境中，存在大量对RNA有强烈降解作用RNase。RNase是一类生物活性非常稳定的酶类。这种酶耐酸、耐碱、耐高温，如煮沸也不能使之完全失活。蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液及唾液中均存在RNase，因此在提取RNA时，关键要避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解。1提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备塑料制品：如试管、EP管、Tip头，使用灭菌的一次性用品。玻璃

4、用品：如烧杯、试管和其他用品，常被RNase污染，使用前必须于180oC干燥8小时以上，或用0.1轕C水(焦碳酸二乙酯)浸泡处理。DEPC是RNase的强抑制剂，作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。37浸泡2小时，然后用灭菌水漂洗数次，于100干烤15分钟，去除器皿上残余DEPC。所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。严格来说，所有溶液均应用0.1轕C于37处理12小时以上，然后于100加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。2RNA提取中RNase污染的控制最主要的潜在污染源是

5、操作人员的手，手直接触摸之处毫无疑问会留下RNase，另外，说话带出的唾液也富含RNase，故在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩。实验中，如接触了“脏的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能污染RNase，因此RNA提取实验中，应勤换手套。RN A提取方法下面以异硫氰酸胍结合氯仿-酚提取法介绍RNA的提取。异硫氰酸胍是一种强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。RNase虽可耐受多种处理，（如煮沸）而不失活，但却会被4mol/L异硫氰酸胍和-巯基乙醇（破坏RNase蛋白质中的二硫键）等还原剂所灭活，因而可从组织中

6、分离出完整RNA分子。因此上述试剂是制备RNA的常规试剂。200l血清（浆）加入200l 20%PEG60004oC，3小时，12000rpm，4离心15分钟弃上清，加500l裂解液（含异硫氰酸胍、-巯基乙醇等），混匀加50l NaAc，500l饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1），充分混匀，冰浴10分钟412000rpm，离心5分钟小心吸取上层水相移至一新离心管中，避免吸取两相之间的蛋白质，用氯仿-异戊醇再抽提一次加2.5倍体积无水乙醇，冰浴30-60分钟412000rpm，离心10分钟弃上清，沉淀用70%乙醇洗二次，65烘干用10l DEPC水溶解RNA，并加2u RNasin-20保存

7、备用主要内容主要内容一一核酸简介核酸简介二二基因组基因组DNA提取提取三三质粒质粒DNA提取提取四四真核细胞总真核细胞总RNA提取提取五五琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳核酸简介核酸简介p 核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3，5-磷酸磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖核酸核酸(RNA)和脱氧核糖核酸和脱氧核糖核酸(DNA)两类。两类。p DNA主要储存遗传信息。主要储存遗传信息。p RNA主要传递遗传信息。主要传递遗传信息。核酸简介核酸简介 如何分离如何分离RNARNA？如何分离如何分离DNADNA？核酸简介核酸简介质粒

8、质粒DNADNA 质粒质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从从1-200 kb不等，为双链、闭环的不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它具具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息数，并表达所携带的遗传信息。一一核酸简介核酸简介二二基因组基因组DNA提取提取三三质粒质粒DNA提取提取四四真核细胞总真核细胞总

9、RNA提取提取基因组基因组DNADNA提取方法提取方法基因组基因组DNA提取的几种常用方法：提取的几种常用方法：u CTAB法法u SDS法法u 其他方法其他方法基因组基因组DNADNA提取提取CTABCTAB法法p CTAB法原理（法原理（植物植物DNA提取经典方法提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶

10、的，）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。基因组基因组DNADNA提取提取CTABCTAB法法pCTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCl （pH 8.0）EDTA（pH 8.0）NaCl CTAB-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 0.4 M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH 8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或Mn2+离子，

11、抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。基因组基因组DNADNA提取提取CTABCTAB法法pCTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方 组份 Tris-HCl（pH 8.0）EDTA（pH 8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 m

12、M0.4 M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVPPVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNADNA中中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。p CTAB法实验流程法实验流程基因组基因组DNADNA提取提取CTABCTAB法法植物材料植物材料 抽提抽提核酸沉淀核酸沉淀液氮研磨液氮研磨上层溶液上层溶液细胞裂解细胞裂解DNADNA溶液溶液干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤p SDS法原理法原理 S

13、DSSDS是一种阴离子去垢剂，在高温（是一种阴离子去垢剂，在高温（55556565）条件下能裂解细胞，）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐提高盐(KAcKAc或或NHNH4 4Ac)Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的上清液中的DNADNA用酚用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNADNA。基因组基因组DNADNA提取提取SDSSDS法法注：注：SDS法适用于大部分实验材料基因组

14、法适用于大部分实验材料基因组DNA提取。如动物组织、提取。如动物组织、细胞、全血、细菌、酵母等。细胞、全血、细菌、酵母等。pSDS提取缓冲液的配方提取缓冲液的配方基因组基因组DNADNA提取提取SDSSDS法法组份Tris-HCl（pH 8.0）EDTA（pH 8.0）NaCl SDS终浓度50 mM 20 mM 0.4 M 2%Tris-HClTris-HCl（pH8.0pH8.0）：提供一个缓冲环境，防止核酸被破）：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；坏；EDTAEDTA：螯合：螯合MgMg2+2+或或MnMn2+2+离子，抑制离子，抑制DNaseDNase活性；活性；NaClNaCl：提供

15、一个高盐环境，使：提供一个高盐环境，使DNPDNP充分溶解，存在于液相中。充分溶解，存在于液相中。基因组基因组DNADNA提取提取SDSSDS法法p SDS法实验流程（以动物组织为例）法实验流程（以动物组织为例）动物组织动物组织 抽提抽提酒精沉淀酒精沉淀液氮研磨液氮研磨或匀浆或匀浆上层溶液上层溶液细胞裂解细胞裂解DNADNA溶液溶液干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤基因组基因组DNADNA的琼脂糖凝胶电泳检测的琼脂糖凝胶电泳检测小鼠小鼠gDNA电泳图电泳图琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：以琼脂糖凝胶作为以琼脂糖凝胶作为支持物，利用支持物，利用DNADNA分子分子在泳动时的电荷效应和在泳动时的电荷

16、效应和分子筛效应，达到分离分子筛效应，达到分离混合物的目的。混合物的目的。基因组基因组DNADNA提取常见问题提取常见问题p DNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应反应p DNA降解降解p DNA量少量少基因组基因组DNADNA提取常见问题分析提取常见问题分析p DNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应反应DNA中含有蛋白、多糖、多酚类物质中含有蛋白、多糖、多酚类物质 抽提纯化、高盐洗涤抽提纯化、高盐洗涤DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 重新沉淀重新沉淀DNA中残留有金属离子中残留有金属

17、离子 重新重新70%乙醇漂洗乙醇漂洗基因组基因组DNADNA提取常见问题分析提取常见问题分析p DNA降解降解材料不新鲜或反复冻融材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断被机械打断外源核酸酶污染外源核酸酶污染p DNA提取量少提取量少实验材料不佳或量少实验材料不佳或量少 选取新鲜（幼嫩）材料选取新鲜（幼嫩）材料破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分 充分研磨、破壁酶、延长裂解时间充分研磨、破壁酶、延长裂解时间沉淀不完全沉淀不完全 低温、延长沉淀时间低温、延长沉淀时间洗涤使得丢失洗涤使得丢失DNA基因组基因组D

18、NADNA提取常见问题分析提取常见问题分析一一核酸简介核酸简介二二基因组基因组DNA提取提取三三质粒质粒DNA提取提取四四真核细胞总真核细胞总RNA提取提取五五琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳质粒质粒DNADNA提取提取p 质粒质粒DNA提取的方法：提取的方法：碱裂解法碱裂解法煮沸法煮沸法质粒质粒DNADNA提取提取碱裂解法原理碱裂解法原理离心柱型质粒离心柱型质粒DNADNA提取试剂盒工作原理提取试剂盒工作原理 离心柱型质粒离心柱型质粒DNA提取试剂盒采用改进的提取试剂盒采用改进的SDS-碱裂碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态

19、下选择性地结合溶液中的质粒值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐、高液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐、高pH值的值的洗脱缓冲液将纯净质粒洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。从硅基质膜上洗脱。质粒质粒DNADNA提取及检测提取及检测实验准备实验准备1.实验器材实验器材 台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、marker笔、笔、电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。2.实验耗材实验

20、耗材 无菌无菌2 mL/1.5 mL EP管、各规格管、各规格Tip、一次性手套等。、一次性手套等。3.实验试剂实验试剂 质粒小提试剂盒（离心柱型，质粒小提试剂盒（离心柱型，YRBIO)、LB培养基、抗生素、培养基、抗生素、琼脂糖、琼脂糖、DNA Loading Buffer、GoldView核酸染料、核酸染料、TAE电泳缓冲液等。电泳缓冲液等。4.实验材料实验材料 对数期菌株（对数期菌株（pEGFP-N1 in DH5）质粒质粒DNADNA提取提取碱裂解法碱裂解法p 碱裂解法试剂配方碱裂解法试剂配方组分1组分2液25 mM Tris-HCl（pH 8.0）10 mM EDTA（pH 8.0）

21、液0.2 M NaOH1%SDS 液3 M KAc（pH 4.2）RNase A10 g/ml RNase A洗脱液 EB10 mM Tris-HCl（pH 8.0）1 mM EDTA（pH 8.0）质粒质粒DNADNA提取提取实验流程实验流程对数期菌体对数期菌体溶液溶液IIIIII中和中和溶液溶液I I充分重悬充分重悬溶液溶液IIII裂解裂解 上清液上清液 过柱过柱干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤质粒质粒DNADNA溶液溶液离心详细实验步骤请参考说明书！详细实验步骤请参考说明书！质粒质粒DNADNA提取提取电泳检测电泳检测p琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测质粒质粒DNADNA的三种带型：

22、的三种带型：1.1.共价闭合环状共价闭合环状DNADNA分子：质粒分子：质粒双链没有断裂；超螺旋结构；泳双链没有断裂；超螺旋结构；泳动速度动速度最快最快；2.2.半开环半开环质粒质粒DNADNA分子：质粒的分子：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子；一条链断裂；松弛的环状分子；泳动速度泳动速度最慢最慢；3.3.线性线性DNADNA分子：质粒的两条链分子：质粒的两条链均断裂；泳动速度均断裂；泳动速度居中居中。质粒质粒DNADNA提取常见问题提取常见问题p RNA残留残留p 质粒断裂质粒断裂p 量少量少质粒质粒DNADNA提取常见问题分析提取常见问题分析p RNA残留残留 忘记加忘记加RNase A？

23、I液中液中RNase A失效？失效？酶量不够？酶量不够？质粒质粒DNADNA提取常见问题分析提取常见问题分析p 质粒断裂质粒断裂 II 液裂解时间过长？液裂解时间过长？裂解时动作过于剧烈？裂解时动作过于剧烈？质粒质粒DNADNA提取常见问题分析提取常见问题分析p 量少量少凝胶是否有问题？凝胶是否有问题？菌体量少菌体量少菌体重悬不彻底菌体重悬不彻底裂解不完全裂解不完全菌株老化菌株老化严谨型质粒严谨型质粒质粒类型质粒类型严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下进行的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下进行的，每

24、个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。一一核酸简介核酸简介二二基因组基因组DNA提取提取三三质粒质粒DNA提取提取四四真核细胞总真核细胞总RNA提取提取五五琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳总总RNARNA提取提取通用方法通用方法p 异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚法（苯酚法（TRIzol法）法）原理：原理：核酸在中性条件下，因磷酸基解离而带负电荷，这一核酸在中性条件下，因磷酸基解离而带负电荷，这一部分由于水化而溶于水。而在酸性条件下，磷酸基的负电部分由于水化而溶于水

25、。而在酸性条件下，磷酸基的负电荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的处理下，荷消失，水溶性下降。因此，在酸性酚的处理下，DNA向向疏水性的酚层移动，而疏水性的酚层移动，而RNA由于有由于有-OH的存在有亲水性，的存在有亲水性，因此向水层移动。因此向水层移动。 TRIzol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与与蛋白质分离，并将蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使可抽提酸性的苯酚，而

26、酸性苯酚可促使RNA进入水相，离进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中与仍留在有机相中的蛋白质和的蛋白质和DNA便分离开。水相层主要为便分离开。水相层主要为RNA，有机层主，有机层主要为要为DNA和蛋白质。和蛋白质。总总RNARNA提取及检测提取及检测实验准备实验准备1.实验器材实验器材 台式高速冷冻离心机、移液器、定时器、台式高速冷冻离心机、移液器、定时器、marker笔、酒精喷壶、笔、酒精喷壶、电子天平、电泳设备、凝胶成像系统（或紫外透射仪）、紫外分光光度计、电子天平、电泳设备、凝胶成像系统（或紫外透射仪）、紫外分光光度计、微波炉、量

27、筒、试剂瓶、锥形瓶等。微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。2.实验耗材实验耗材 1.5 mL EP管（管（RNase free）、各规格）、各规格Tip（RNase free）、一次性手套、一次性口罩等。一次性手套、一次性口罩等。3.实验试剂实验试剂 TRIzol 总总RNA提取试剂（提取试剂（YRBIO)、氯仿、异丙醇、氯仿、异丙醇、75%乙醇乙醇（RNase free）、）、DEPC H2O（RNase free）等。等。4.实验材料实验材料 新鲜新鲜293细胞细胞p RNase是导致是导致RNA降解的最主要物质！降解的最主要物质！pRNase的来源的来源 样品样品 试剂试剂 多次使用的器具多

28、次使用的器具 裸露的手裸露的手 说话产生的唾沫说话产生的唾沫 空气空气RNase非常稳定，它非常稳定，它在一些极端的条件可在一些极端的条件可以暂时失活，但限制以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复因素去除后有迅速复性。用常规的高温高性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使白抑制剂都不能使RNase完全失活。完全失活。总总RNARNA提取提取去除去除RNaseRNase污染污染p 玻璃器皿处理：玻璃器皿处理：量筒、试剂瓶等玻璃器皿须量筒、试剂瓶等玻璃器皿须200烘烤烘烤2小时以上。小时以上。p 塑料器皿处理：塑料器皿处理：0.1%DEPC水溶液浸泡过夜，再高温高压灭菌

29、。水溶液浸泡过夜，再高温高压灭菌。p 试剂处理：试剂处理：氯仿、异丙醇、无水乙醇新开后氯仿、异丙醇、无水乙醇新开后RNA专用。专用。0.1%DEPC水水配制配制75%的酒精。的酒精。p 专用的专用的RNA操作室、专用器械。操作室、专用器械。p 操作时戴口罩、手套、帽子、穿实验服。操作时戴口罩、手套、帽子、穿实验服。总总RNARNA提取提取样本准备样本准备p 植物植物/动物组织样本：动物组织样本：新鲜取材或组织离体后液氮速冻，存于液氮或新鲜取材或组织离体后液氮速冻，存于液氮或-80。为避免反复冻融，需小份分装（为避免反复冻融，需小份分装（50100 mg/份）份）。p 细胞样本：细胞样本：新鲜收

30、集待用或加入新鲜收集待用或加入TRIzol后后-80冻存细胞沉淀。冻存细胞沉淀。p 血液样本：血液样本：新鲜血液分离出淋巴细胞，待用或加入新鲜血液分离出淋巴细胞，待用或加入TRIzol后后-80冻存细胞沉淀。冻存细胞沉淀。真核细胞总真核细胞总RNARNA提取提取实验步骤实验步骤p 293细胞样品为例细胞样品为例收集细胞收集细胞上层溶液上层溶液 离心洗涤离心洗涤裂解变性裂解变性异丙醇沉淀异丙醇沉淀 抽抽 提提RNARNA溶液溶液干燥溶解干燥溶解详细实验步骤请参考说明书！详细实验步骤请参考说明书！总总RNARNA提取提取完整性检测完整性检测293细胞总RNA28S18S5S 由于动物细胞中由于动物

31、细胞中70-80%的的RNA为为rRNA，后者又由后者又由28S（约（约4800 nt），），18S（约（约1900 nt）和和5.8S（约（约120 nt）三种组成，所以电泳后应该）三种组成，所以电泳后应该在在UV下看见三条清晰的下看见三条清晰的rRNA带。带。由于核酸长度与结合由于核酸长度与结合EB的数量成正比，所的数量成正比，所以以28S rRNA条带的荧光强度一般比条带的荧光强度一般比18S rRNA条带的荧光强度强条带的荧光强度强1.5-2.3倍。如果这两条倍。如果这两条rRNA带不清晰或比例小于此范围则表示带不清晰或比例小于此范围则表示RNA有降解有降解（因为大的（因为大的RNA被

32、酶降解的可能更大）。被酶降解的可能更大）。p电泳检测电泳检测总总RNARNA提取提取产量产率与纯度检测产量产率与纯度检测1.打开紫外分光光度计设定参数，具体操作参照打开紫外分光光度计设定参数，具体操作参照仪器说明。仪器说明。2.取少量待测取少量待测RNA样品，用样品，用TE Buffer稀释稀释50倍倍（或（或100倍）。倍）。3.用用TE Buffer做空白，在做空白，在260 nm、280 nm、310 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。处调节紫外分光光度计的读数至零。4.加入待测加入待测RNA样品在三个波长处读取样品在三个波长处读取OD值。值。总总RNARNA提取提取产量产率与纯度检测

33、产量产率与纯度检测5.根据根据OD值计算值计算RNA的浓度：的浓度：SSRNA=40(OD260OD310)稀释倍数稀释倍数6.RNA产量产率计算：产量产率计算：RNA 的产量的产量=RNA浓度浓度溶解体积溶解体积 RNA的产率的产率=RNA产量产量/细胞用量细胞用量7.根据根据OD值计算值计算RNA的纯度的纯度 纯纯RNA样品的样品的OD260/OD280 大约在大约在1.8-2.0之间。之间。RNARNA提取常见问题提取常见问题p RNA降解降解p DNA残留残留p OD260/OD280 比值偏低比值偏低p 电泳带型异常电泳带型异常RNARNA提取常见问题分析提取常见问题分析p RNA降

34、解降解外源外源RNase的污染的污染裂解液质量裂解液质量裂解液用量不足裂解液用量不足样品本身富含样品本身富含RNase环境温度过高环境温度过高28S18S5SRNARNA提取常见问题分析提取常见问题分析p DNA残留残留 样本量过多样本量过多 吸取到中间层及下层试剂吸取到中间层及下层试剂解决办法：解决办法：DNA酶（酶（RNase free）消化，）消化，再抽提纯化处理。再抽提纯化处理。RNARNA提取常见问题分析提取常见问题分析p OD260/OD280 比值偏低比值偏低蛋白污染蛋白污染/苯酚残留苯酚残留 加入氯仿后彻底混匀，并且离心分层的离心力加入氯仿后彻底混匀，并且离心分层的离心力 和时

35、间要足够。和时间要足够。不要吸入中间层及有机相，宁愿多损失些上清。不要吸入中间层及有机相，宁愿多损失些上清。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。解决办法解决办法:重新抽提一次，再沉淀、溶解。重新抽提一次，再沉淀、溶解。RNARNA提取常见问题分析提取常见问题分析p 电泳带型异常电泳带型异常上样量超过上样量超过 3g 电压超过电压超过 8V/cm 电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液陈旧 均可能导致均可能导致 28S 和和 18S 条带分不开条带分不开一一核酸简介核酸简介二二基因组基因组DNA提取提取三三质粒质粒DNA提取提取四四真核细胞总真核细胞总RNA提取提取五五琼脂

36、糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳1.原理：原理：DNADNA分子在高于其等电点的分子在高于其等电点的pHpH溶液中带负电溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。而琼脂糖凝胶具有分荷，在电场中向正极移动。而琼脂糖凝胶具有分子筛作用，不同分子量或分子形状的核酸，其移子筛作用，不同分子量或分子形状的核酸，其移动速度有差异。因此，利用这种动速度有差异。因此，利用这种“电荷电荷”和和“分子筛分子筛”的双重效应，达到分离核酸的目的。的双重效应，达到分离核酸的目的。DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳2.琼脂糖凝胶分离琼脂糖凝胶分离DNA的范围的范围DNADNA的琼脂

37、糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳3.DNA染料染料 A:EB A:EB 溴化乙锭溴化乙锭(EthidiumEthidium Bromide,EBBromide,EB）可以嵌入核酸双可以嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。EB EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-15-2020minmin；不会使核酸断裂；灵敏度高，不会使核酸断裂；灵敏度高，1010ngng或更少的或更少的DNADNA即可检出；可以直接加到样品中或胶中；价格低廉。即可检出；可以直接加到样品中或胶中；价格低廉。EBEB是诱变剂

38、是诱变剂，使用时一定要戴手套。，使用时一定要戴手套。EBEB废液要经过废液要经过处理才能丢弃。处理才能丢弃。B B：新型：新型低毒染料低毒染料：如如Gold ViewGold View、SYBR GreenSYBR Green、SYBR GoldSYBR Gold等。等。毒性较低，但价格较昂贵。毒性较低，但价格较昂贵。灵敏度较好，但不如灵敏度较好，但不如EBEB。DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳4.琼脂糖胶液制备（琼脂糖胶液制备（1%，50 ml）4.14.1 称取称取0.5 g0.5 g琼脂糖，置于琼脂糖，置于250 ml250 ml锥形瓶中，加入锥形瓶中，加入60 ml 160

39、 ml 1TAETAE电泳缓冲液，微波炉中加热，使琼脂糖溶电泳缓冲液，微波炉中加热，使琼脂糖溶解。一般需反复煮沸解。一般需反复煮沸3 3次，琼脂糖才能充分溶解。加热过次，琼脂糖才能充分溶解。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发；加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发；4.2 4.2 待胶液冷却至待胶液冷却至6060左右时，加入左右时，加入5%5%的的Gold ViewGold View染料，混匀，既成琼脂糖胶液。染料，混匀，既成琼脂糖胶液。DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳5.凝胶板的

40、制备凝胶板的制备 5.1 5.1 将胶槽置于水平支持物上，将琼脂糖胶液倒入将胶槽置于水平支持物上，将琼脂糖胶液倒入胶槽中，使凝胶厚度约为胶槽中，使凝胶厚度约为0.3-0.5 cm0.3-0.5 cm，赶走气泡后，赶走气泡后迅速插上梳子，让胶凝固。迅速插上梳子，让胶凝固。5.2 5.2 待凝胶完全凝固后（约待凝胶完全凝固后（约2030 min2030 min），小心），小心从一侧取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入电泳从一侧取出梳子，将凝胶板置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，让液面高出胶面缓冲液，让液面高出胶面1 mm1 mm左右。左右。DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳6.加样加样 取待

41、检测样本适量，按照取待检测样本适量，按照5 5份上样液搭配份上样液搭配1 1份份 6 6DNA DNA Loading BufferLoading Buffer的比例混匀（注意不要产生气泡），的比例混匀（注意不要产生气泡），用微量移液器小心加入样品槽中。每加完一个样品要更用微量移液器小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换枪头，以防止交叉污染。注意上样时要小心操作，避换枪头，以防止交叉污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳7.电泳电泳 加完样后立即接通电源。控制电压小于加完样后立即接通电源。控

42、制电压小于8 8 V/cmV/cm，电流在电流在100100 mAmA以上。当溴酚蓝条带移动到凝胶以上。当溴酚蓝条带移动到凝胶2/32/3时，时，停止电泳。停止电泳。8.成像成像 在紫外透射仪或凝胶成像系统上观察电泳结果。保在紫外透射仪或凝胶成像系统上观察电泳结果。保存图像。存图像。内容回顾内容回顾1.基因组基因组DNA提取提取pCTAB法法pSDS法法2.质粒质粒DNA提取提取p碱裂解法（离心柱型）碱裂解法（离心柱型）3.总总RNA提取提取p异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚法（苯酚法（TRIzol法）法）4.DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳下午实验课（下午实验课（14:30-18:00）质粒质粒DNA提取及琼脂糖电泳分析提取及琼脂糖电泳分析