FISH技术及其临床应用课件.ppt

1、1荧光原位杂交技术及其在医学中的应用FISH methods and its medical application一、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH)60年代 Pardue Gall 建立（一）方法与原理：制备DNA探针（用生物素或荧光素标记）（下图）变性制备CS或间期细胞标本变性处理探针与待测DNA杂交洗脱用荧光素标记的生物素亲和蛋白使杂交区发荧光（信号放大）(下图）荧光显微镜检测2（二）探针制备方法1.缺口平移法(Nick translatrion)用生物素（biotin)标记dUTPDNA酶切口DNApolymerase 5

2、3外切酶活性DNApolymerase 53聚合酶活性3BdUTP45335DNAse5335OHp DNA聚合酶标记核苷酸G GCOHOHOHOHpBBGCUAUA53355 33 5分子杂交与信号放大5BBB荧光素荧光素亲和蛋白亲和蛋白抗体抗体探针探针待测基因待测基因CCGAGGCTGGCUCCGA(略）略）2.随机引物法（随机引物法（random primer):6聚核苷酸聚核苷酸 klenow酶酶6FISH ProcedureDenature the chromosomesDenature the probeHybridizationFluorescence stainingExami

3、ne slides or store in the dark7（三）探针种类1）探针池探针（cs涂抹探针）：可结合在整条CS上每一部位。24色（常CS22条XY）89Whole chromosome probes10Whole chromosome probes 112）着丝粒探针：结合于着丝粒处，检测间期核内DNA数（CS数）121314Repetitive sequence probes3）端粒探针：结合于端粒处15164)特异位置探针特异位置探针:cs某一具体位置探针某一具体位置探针 例：例：Yq12 repetitive probe1718位点特异性探针5）染色体臂涂抹探针：结合于cs

4、的q或p上。19（四）探针标记方法间接标记（前述）时间长 信号明显直接标记 时间短 信号弱20二、FISH种类：以FISH过程中探针结合部位或探针颜色的不同，将FISH分为多种。21221.Centromere Single Color FISH232.Single Color FISH(Telomeres)243.Dual color FISH254 4 多色荧光原位杂交多色荧光原位杂交265.Spectral Karyotyping(SKY)（光谱核型分析）（光谱核型分析）276.24 colors FISH287.M-FISH with telomeres and centromeres

5、29M-FISH with chromosome banding specific probes308.间期FISH三、FISH优点（Advantage）:less labor-intensive method for confirming the presence of a DNA segment within an entire genome than other conventional methods31FISH-a process which vividly paints chromosomes or portions of chromosomes with fluorescent

6、moleculesidentify the presence and location of a region of DNA within morphologically preserved chromosome preparations,then can identifies chromosomal abnormalitiesoften used during M phase but is now used on interphase as well32四、FISH在医学中的应用举例1、用已知探针检测未知CS畸变332、用显微切割方法检测未知用显微切割方法检测未知CS畸变畸变 显微切割显微切

7、割PCR CS特异探针特异探针池池(黄色荧光黄色荧光)与正常人与正常人CS杂交杂交(例例:2号染色体某段发黄色荧光号染色体某段发黄色荧光)结果？结果？343、产前诊断 例:检测间期细胞内DNA分子数 例：21三体例：18三体354、植入前诊断36Preimplantation Genetic Diagnosis(PGD)37图示1例13/14罗式易位携带者的胚胎植入前FISH诊断资料：一对6年不育，女，32岁，cs正常，男34岁，核型：4545，XY,t(13;14)(q10;q10),XY,t(13;14)(q10;q10),并伴少、弱精。采用单精子卵泡浆（intracytoplasmics

8、perm intracytoplasmicsperm injection,ICSI)injection,ICSI)辅助授精，胚胎发育到3天6-8细胞期取出一个细胞进行双色FISH检测。参图：用13q和14q探针，见核中2个13号（绿色）和2个14号（红色）信号细胞，表明？38移植后18周做羊水细胞CS检查39PGD5、肿瘤诊断 肿瘤诊断探针检测间期细胞内DNA分子数肿瘤细胞内有癌基因扩增4041肿瘤诊断42慢性粒细胞白血病43慢性粒细胞白血病44慢性粒细胞白血病456.微小染色体畸变检测46Microdeletion 7.遗传病诊断 （图）例1：家系1 FISH结果用XcsXcs着丝粒着丝粒探

9、针（绿色）和DMD DMD exon46exon46探针(红色）杂交。图示DMD男患者FISH结果：只有XcsXcs着丝着丝粒粒绿色信号，无信号，无DMDDMD exon46 exon46红色信号，信号，说明？说明？477.遗传病诊断 （图）48 图示：DMD男患者姐姐2条XcsXcs均有均有DMD DMD Exon46Exon46信号(红色）。表明？7.遗传病诊断 （图）49图示：DMD男患者妹妹只有1条XcsXcs上有上有DMD DMD Exon46Exon46信号。表明？7.遗传病诊断 （图）50例2：家系2FISH结果在DMD患者母亲1/3淋巴细胞中仅有1条Xcs上有DMD Exon4

10、6DMD Exon46杂交杂交信号，另一条上无。7.遗传病诊断 （图）51图示：在DMD患者母亲2/3淋巴细胞中在2条Xcs上有DMDExon46DMDExon46杂交杂交信号。A和B结果表明？7.遗传病诊断 （图）52例3：图示1复杂易位患者FISH结果（该患者致妻流产3次）核型：4646，XYXY，t t（5 5；2020；1616）(q35;p13;q21)(q35;p13;q21)三色三色FISHFISH（5q5q绿色绿色;16q;16q橙色；橙色；20p20p蓝色）蓝色）结果参结果参图：图：a:5a:5号号;b:;b:衍生衍生5 5号号;c:16;c:16号号;d:;d:衍生衍生16

11、16号号;e;e：2020号号;f;f：衍生衍生2020号号.53例4 FISH技术从母血中检测胎儿有核红细胞图示：孕早期母血中胎儿有核红细胞，可见YCS特异杂交信号。54例5 13q部分三体致斜颈、不对称脸、右脸小，用13q探针检测（黄色信号）。图示：2条13号CS，另一13号接到1号短臂上。55图示：该患者G带核型56例6 白血病患者骨髓细胞双色FISH 8、基因定位(略)（参下页图)附:FISH试剂盒例子（参资料）5758IB665B376B12IB568D11S4170D11S1348D11S921D11S1322D11S935D11S4045D11S3969D11S1779D11S1330B344A5D11S4205IB3011D11S4172D11S1362AFM337TC5D11S4143D11S1886D11S1343D11S4078D11S1793D11S4129D11S4107D11S4089D11S4402D11S4094D11S4399B1005B31111.111.2111.2213.213.313.1242514.214.314.113.413.52112131415.115.215.315.415.5111222.322.222.123.223.123.3The Visible Genetic Map of Human Chromosome 11