临床微生物学检验(同名210)课件.pptx

1、临床微生物学检验各种微生物的鉴定流程革兰阳性菌的简易鉴定流程接种不规则，棒状杆菌属24h观察菌落形态Bap生长良好参阅革兰阴性杆菌鉴定流程图转纯MAC生长良好G+球菌 革兰阳性球菌 成队、成链排列 凝固酶阴性 葡萄球菌或微球菌 革兰染色形态金葡菌CAMP实验溶血李斯特杆菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌规则杆状触酶+G+杆菌触酶-凝固酶阴性凝固酶阳性否B群链球菌 肺炎链球菌其他 草绿色链球菌或 肠球菌结果GP卡是其他链球菌，化脓链球菌调菌悬液0.85-0.9麦氏点，上GP卡出结果G+圆形卵圆形YST卡结果革兰阴性菌（非粪便中）简易鉴定流程 接种 Bap生长良好MAC生长良好铜绿单胞菌粉红色或红色菌落 较小

2、、无色透明半透明菌落分纯MAC24h菌落有金属色泽 葡萄气味OX阳性调菌悬液0.65-0.7麦氏点，上GN卡BAP上/迁移生长24h出鉴定结果阴性是洋葱伯克霍尔德菌 类鼻疽伯克氏菌、巴斯德菌、其他否是变形杆菌属否大肠杆菌、沙雷菌,枸橼酸菌属,肠杆菌属,嗜麦芽窄食单胞菌,不动杆菌属,部分洋葱，其他上机接种MACTCBSSS24h无色、透明半透明菌落中心黑色菌落黄色菌落24h凝集G-,鱼群排列的弧菌革兰染色米泔水样便凝集诊断学清可疑沙门菌可疑志贺菌KIA、MIU疑似霍乱弧菌诊断学清诊断学清上机凝集上报疾控中心及主管部门出结果联系临床，询问病史扁平无色半透明蜡滴状蓝绿色疑似副溶血粪便中细菌（肠道粪便

3、菌）鉴定流程图 巧克力平板用于分离，BAP平板上在没有添加V因子的情况下不生长流感嗜血杆菌 脑膜炎奈瑟氏菌、淋病奈瑟氏菌（卡他莫拉氏菌）接种血琼脂平板巧克力平板CO2培养箱24h光滑湿润透明或半透明菌落结果GN卡上机OX阳性、H2O2阳性G-球菌双球菌3种革兰氏阴性双球菌可能存在的部位 淋病奈瑟氏菌是阴道和咽部的致病菌,关节液中罕见 脑膜炎奈瑟氏菌是脑脊液、血标本中的致病菌,阴道(肛门)和痰中罕见 卡他莫拉氏菌是仅为痰、耳、眼睛和窦吸取物中的致病菌厌氧菌鉴定临床标本液体培养基（曾军）厌氧血平板、选择培养基庖肉培养基需氧培养24h厌氧培养48h48 h挑4-6个形状不同菌落，分别接种厌氧需养血琼

4、脂平板确定是否厌氧菌接种平板需氧培养接种平板厌氧培养不生长生长涂片革兰染色厌氧培养48h需氧培养分离，生化试验，鉴定菌落观察，形态染色专性厌氧菌兼性厌氧或需养生长L型细菌 细菌L型是细菌因变异而产生的细胞壁缺陷型。根据其细胞壁的缺陷程度不同可分为两类：原生质体和圆球体。细菌L型呈杆状、丝状、圆形或卵圆形等多种形态，大小差别很大。因细胞壁缺失，革兰染色常发生改变，革兰阳性菌变为L型后，可染成阴性（有时仍为阳性）。在同一张片子上可同时见到革兰阳性及阴性菌，着色不均。细胞壁染色，菌体呈深紫色。细菌 L型需在高渗和营养丰富的条件下才能生长，生长缓慢，培养27天可见生长。在液体培养基中，呈颗粒状生长，颗

5、粒可粘附于管壁或沉淀于管底。在固体培养基中，有3种类型：“油煎蛋”样（L型）、颗粒状（G型）菌落、和丝状（F型）菌落。真菌培养 可疑隐球菌属YST卡酵母菌阳性圆形卵圆形菌体革兰染色24h沙保培养基标本墨汁负染粘液淡褐色鉴定可疑霉菌属可见分生孢子头和足细胞24h厚膜孢子实验上机鉴定牙管形成实验少量菌落阴性阳性再培养24h白色念珠菌各种鉴定试验革兰染色 原理：细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它溶解，所以染色的前二步结果是一样的，但在G+细胞中，乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙

6、变小，由于结晶紫和碘的复合物分子太大，不能通过细胞壁，保持着紫色。在G细胞中，乙醇处理不但破坏了胞壁外膜，还可能损伤肽聚糖层和细胞质膜，于是被乙醇溶解的结晶紫和碘的复合物从细胞中渗漏出来，当再用衬托的染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，红色显示不出来。涂片龙胆紫液染色10s，水洗，甩干复染脱色初染媒染固定其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。目的：1、杀死细菌；2、使菌体与玻片粘附牢固；3、菌体蛋 白变性，易于着色。经火焰固定待干镜检目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较。帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用

7、细菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区分。革兰阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰阴性细菌则易被脱色。酒精脱色10-20s，水洗，甩干碘溶液染色10s，水洗，甩干使细菌各成分着色砂黄溶液，8s，水洗，甩干红色紫色革兰阴性菌革兰阳性菌抗酸染色 原理:分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。涂片固定复染脱色初染使各成分脱色，抗酸杆菌不易脱色镜检蓝色背景下，染成红色细长或略带弯曲的杆菌，并有分支趋向。酸性酒精溶液，2min，水洗甩干使各成分着色石碳酸复红溶液，5min，水洗甩干

8、经火焰固定目的：1、杀死细菌；2、使菌体与玻片粘附牢固；3、菌体蛋 白变性，易于着色。复染各成分成蓝色亚甲基蓝溶液，30s，水洗甩干氧化酶实验 原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化性细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。步骤：取洁净的滤纸一小块，蘸取菌苔少许，加1滴10g/L盐酸二甲基对苯二胺溶液于菌落上，观察颜色变化。氧化酶阳性触酶实验 原理:具有触酶(过氧化氢酶)的细菌，能催化过氧化氢，放出新生态氧，继而形成分子氧，出现气泡。步骤：取3%过氧化氢溶液0.5ml，滴加于不含血液的细菌琼脂培养物上，或取13ml滴加入

9、盐水菌悬液中。触酶阳性CAMP实验 原理：B群链球菌具有“CAMP”因子，能促进葡萄球菌溶血素的活性,使两种细菌在划线处呈现箭头形透明溶血区。操作步骤：先用产溶血素的金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上划一横线，再取待检的链球菌与前一划线作垂直划线接种，两者相距0.51cm。置35C孵育1824小时，观察结果。OPTOCHIN实验 原理：Optochin可干扰肺炎链球菌叶酸的生物合成，抑制该菌的生长，故肺炎链球菌对其敏感，而其他链球菌对其耐药。操作步骤：将待检的溶血的链球菌均匀地徒步在血琼脂平板上，贴放Optochin纸片（含药5ug），35C孵育1824小时，观察抑菌圈的大小。左侧为奥普托欣检测阳性

10、，右侧为阴性杆菌肽实验 原理：A群链球菌对杆菌肽敏感，而其他群链球菌对杆菌肽耐药。方法：挑取被检菌落，密涂于血琼脂平板上，接种量应大，以免出现假阳性。贴上杆菌肽纸片，35过夜。相关抗原抗体检测肺炎支原体检测原理：本培养和检测根据肺炎支原体在宿主细胞内代谢积累分解葡萄糖，通过化学显色的方法在较短的时间内快速检测出肺炎支原体。干粉培养基1.5ml超纯水置35-37温箱孵育24小时充分溶解阴性孔加50ul棉拭子于培养瓶中搅动数次取出棉拭子，弃去混匀每空吸取50ul石蜡油液封观察结果结果判断沙眼衣原体抗原检测 检验原理：用抗衣原体脂多糖单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体分别固定于固相硝酸纤维素膜，并和

11、胶体金标记的另一抗衣原体脂多糖单克隆抗体及其他试剂和原料制成，应用胶体金免疫层析技术，采用双抗体夹心的形式建立的衣原体检测方法，用于女性宫颈和男性尿道中沙眼衣原体抗原的检测。结果判读阴性结果：仅质控线（C）有一条红线，检测线（T）无红线出现；阳性结果：除质控线外，另有一条红线出现在检测（T）；无效结果：质控线不出现红线，则结果无效。沙门、志贺菌血清学实验 原理：用已知的沙门菌或志贺菌诊断血清在载玻片上直接与细菌培养物或菌悬液混合，若出现肉眼可见的特异性凝集块，表示该菌即为沙门菌或志贺菌。操作步骤：沙门菌：1、首先用可凝菌与沙门菌O多价血清（A-F）进行凝集，若呈明显凝集，提示被检菌株可能属于A

12、F6个O群范围内，再用H因子第一相（特异相）定型，最后用H因子第二相（非特异相）辅助定型。2、若生化反应符合沙门菌，但AF多价血清不凝集，首先考虑是否出现表面抗原（Vi抗原），因为Vi抗原能阻断O抗原与相应抗体发生凝集，加热可将其破坏。应将细菌制成菌悬液，放入沸水中加热1530分钟，冷却后再次做凝集试验。若去除Vi抗原后仍不凝集，此时应考虑是否为AF以外菌群，应送专业实验室进行鉴定。志贺菌：1、首先用志贺菌属4种多价血清作玻片凝集，如凝集再进一步作血清定型（用福氏志贺菌16型、痢疾志贺菌12型、鲍氏志贺菌16型以及宋内志贺菌鉴定到种、型）。一般先用福氏志贺菌血清凝集，因我国以B群最为多见，如出

13、现生化反应符合志贺菌，而与4种多价血清不凝集的菌株，应考虑为K抗原存在，将菌液加热到100C1530分钟后再进行凝集。2、与各型志贺菌血清不发生凝集，菌落特征与生化反应似痢疾志贺菌，可考虑非典型痢疾血清型，应送到专业实验室进行鉴定。结果判断：阴性：试验一侧及对照一侧均匀混浊。阳性：对照一侧均匀混浊，实验一侧明显凝集。自凝：实验一侧及对照一侧凝集。抗菌药物敏感性试验K-B法药敏实验 方法原理：纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓

14、度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。简易操作程序：选择纯培养菌落贴特定药敏纸片药敏平板平衡室温涂布接种法接种药敏平板调0.5麦氏点菌悬液根据规则判断敏感中介和耐药结果报告用直尺量抑菌环直径35-37温箱孵育24hVITEK2-compact微生物鉴定及药敏操作程序分纯细菌输入细菌放入鉴定仪填充仓插相应卡片调节到相应比浊菌液0.45%NaCl溶液调节菌悬液3ml蓝色箭头闪亮将载卡架取出并放入装载仓蓝色指示灯闪亮按“充入”取145ul菌液加入到3ml0.45%NaCl溶液中出鉴定结果编号取出载卡架插相应卡片出药敏结果人工判断结果并出报告谢谢！