255亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与乳腺癌新辅助化疗敏感性关系课件.ppt

1、亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性与乳腺癌新辅助化疗敏感性关系的研究探讨 乳腺癌（breast cancer)是女性最常见的恶性肿瘤，近年来乳腺癌的发病率呈现着上升趋势。据统计目前全世界每年死于乳腺癌的病例约为41万人，约占女性全部癌症死亡病例的14%，居女性癌症死因的首位或第二位。研究目的和意义研究目的和意义目的：目的：研究亚甲基四氢叶酸还原酶（研究亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFRMTHFR）基因）基因 C677T C677T、A1298CA1298C多态与乳腺癌患者对新辅助多态与乳腺癌患者对新辅助 化疗敏感性的关系。化疗敏感性的关系。意义：意义：寻找可靠的预测指标指导寻找可靠的预测指标指导个体

2、化治疗个体化治疗,从而从而 为进一步实现乳腺癌为进一步实现乳腺癌规范化综合治疗规范化综合治疗提供参提供参 考依据。考依据。研究对象研究对象2008年1月至2009年4月在江苏省肿瘤医院就诊的61例乳腺癌患者新辅助化疗新辅助化疗恶性证据恶性证据可测量病灶可测量病灶术后病理术后病理 评定标准评定标准 化疗疗效的评定标准：化疗疗效的评定标准：参照参照WHOWHO实体瘤疗效评定标准实体瘤疗效评定标准 分为完全缓解分为完全缓解(CR)(CR)、部分缓、部分缓解解(PR)(PR)、无变化、无变化(SD)(SD)和进展和进展(PD)(PD)。以以CR和和PR为有效为有效 化疗后病理反应分级标准化疗后病理反应

3、分级标准 0级：癌细胞没有变化；I级：癌细胞有轻度变化或有显著变化但2/3的 范围 II级 癌细胞显著变化达2/3或以上 III级 癌细胞完全消失或坏死，被肉芽组织和(或)纤维组织替代 把IIII级定为病理有反应！实验技术路线实验技术路线 白细胞层白细胞层DNA提取步骤提取步骤 MTHFR C677T 多态性检测方法多态性检测方法 结果判断结果判断 Hinf I酶切酶切MTHFR 677基因基因DNA片段产物电泳图片段产物电泳图 MTHFR A1298C多态性检测方法多态性检测方法 结果判断结果判断 Mbo 酶切酶切MTHFR A1298C基因基因DNA片段产物电泳图片段产物电泳图试剂试剂:w

4、4 4dNTPsdNTPs（宝生物工程（宝生物工程(大连大连)有限公司有限公司)w引物（宝生物工程引物（宝生物工程(大连大连)有限公司有限公司)wTaqTaq 酶酶(北京博瑞科技有限公司北京博瑞科技有限公司)w限制性内切酶限制性内切酶HinfHinf I(I(宝生物工程宝生物工程(大连大连)有限公司有限公司)w1010Buffer(Buffer(宝生物工程宝生物工程(大连大连)有限公司有限公司)仪器仪器:wPCR PCR 扩增仪两台扩增仪两台(美国美国MJMJ公司，德国公司，德国BiometraBiometra公司公司)w冷冻高速离心机冷冻高速离心机(0(016000r/min)(16000r

5、/min)(德国德国EppendorfEppendorf公司公司)w可调式移液器可调式移液器(0(02 2l,0l,0100100l,0l,010001000l)(GILSONl)(GILSON公司公司)MTHFR C677T基因多态性检测方法基因多态性检测方法PCR扩增MTHFR 677基因片段 (198bp)MTHFR 677基因型检测 （Hinf I酶切PCR扩增产物）结果判断 结果判断结果判断1）当为677C/C基因型时，PCR产物不能被限制性内切酶Hinf I 酶所识别，PCR产物则不能被消化，琼脂糖凝胶上表现为198bp片段，可清晰见到198bp一条亮带。2）当为677T/T基因型

6、时，PCR产物被限制性内切酶Hinf I酶消化后可产生175bp、23bp二个新的片段。其中23 bp的片段由于太短而无法在凝胶上清楚的显示，故琼脂糖凝胶上只可清晰的见到175bp一条亮带。3）当为677C/T基因型时，可产生198bp、175bp、和23bp三个片段。其中23bp的片段由于太短而在凝胶上无法清楚显示，故琼脂糖凝胶上只清晰见到198bp和175bp两条亮带。Hinf I酶切酶切MTHFR 677基因基因DNA 片段产物电泳图片段产物电泳图wlane 1:Maker;wlane 2:C/C genotype;wlane 3:C/T genotype;wlane 4:T/T gen

7、otype.198bp175bp试剂试剂:w4 4dNTPsdNTPs（宝生物工程（宝生物工程(大连大连)有限公司有限公司)w引物（宝生物工程引物（宝生物工程(大连大连)有限公司有限公司)wTaqTaq 酶酶(北京博瑞科技有限公司北京博瑞科技有限公司)w限制性内切酶限制性内切酶Mbo Mbo（宝生物工程（宝生物工程(大连大连)有限公司有限公司)w1010Buffer(Buffer(宝生物工程宝生物工程(大连大连)有限公司有限公司)仪器仪器:wPCR PCR 扩增仪两台扩增仪两台(美国美国MJMJ公司，德国公司，德国BiometraBiometra公司公司)w冷冻高速离心机冷冻高速离心机(0(0

8、16000r/min)(16000r/min)(德国德国EppendorfEppendorf公司公司)w可调式移液器可调式移液器(0(02 2l,0l,0100100l,0l,010001000l)(GILSONl)(GILSON公司公司)MTHFR A1298C基因多态性检测方法基因多态性检测方法 PCR扩增MTHFR A1298C基因片段 (84bp)MTHFR A1298C基因型检测 （Mbo酶切PCR扩增产物）结果判断 结果判断结果判断1）当为1298A/A基因型时，PCR产物被限制性内切酶Mbo 消化后可产生56bp、28bp二个新的片段。其中28bp的片段由于太短而在凝胶上无法清楚

9、显示，故琼脂糖凝胶上只可清晰见到56bp一条亮带。2）当为1298A/C基因型时，可产生84bp、56bp、和28bp三个片段。其中28bp的片段由于太短而在凝胶上无法清楚显示，故琼脂糖凝胶上只可清晰见到84bp和56bp两条亮带。Mbo 酶切酶切MTHFR A1298C基因基因 DNA片段产物电泳图片段产物电泳图wlane 1:Maker;wlane 2:Product of PCR；wlane 3:A/A genotype;wlane 4:A/C genotype.56bp84bpGenetypeGenetypeC677TC677TA1298C A1298C typetypeT/TT/TC

10、/TC/TC/CC/CA/AA/AA/CA/CC/CC/Cn n181829291414444417170 0Effects of chemotherapyEffects of chemotherapy X X2 2 P P CR+PR(%)SD+PD(%)CR+PR(%)SD+PD(%)15(83.3)3(16.7)15(83.3)3(16.7)21(72.4)8(27.6)21(72.4)8(27.6)6(42.9)8(57.1)6(42.9)8(57.1)31(70.5)13(29.5)31(70.5)13(29.5)11(64.7)6(35.3)11(64.7)6(35.3)0 0 0

11、 0 0.72 0.400.72 0.40 5.54 5.54 0.020.02 0.19 0.67 0.19 0.67GenetypeGenetypeC677TC677TA1298C A1298C typetypeT/TT/TC/TC/TC/CC/CA/AA/AA/CA/CC/CC/Cn n181829291414444417170 0 reaction rate of chemotherapy X X2 2 P P 0(%)0(%)(%)(%)3(16.7)15(83.3)3(16.7)15(83.3)10(34.5)19(65.5)10(34.5)19(65.5)9(64.3)5(35.

12、7)9(64.3)5(35.7)13(29.5)31(70.5)13(29.5)31(70.5)9(52.9)8(47.1)9(52.9)8(47.1)0 0 0 0 1.72 0.191.72 0.19 7.38 7.38 0.010.01 2.86 0.09 2.86 0.09 5,10-MTHF 5MTHFMTHFR同型半光氨酸同型半光氨酸蛋蛋 氨氨 酸酸s-s-腺苷蛋氨酸腺苷蛋氨酸蛋氨酸合成蛋氨酸合成酶酶甲基供体甲基供体 DNADNA的低的低 甲基化甲基化DNADNA修复修复能力降低能力降低化疗敏感化疗敏感性的变化性的变化 DNADNA的甲基化的甲基化 MTHFR genovariat

13、ionMTHFR 677 TMTHFR 677 TT T患者的化疗疗效患者的化疗疗效MTHFR 677 TMTHFR 677 TT TI IIIIIII级化疗反应率级化疗反应率MTHFR 677 CMTHFR 677 CC C患者的化疗疗效患者的化疗疗效MTHFR 677 CMTHFR 677 CC CI IIIIIII级化疗反应率级化疗反应率MTHFR 677 CMTHFR 677 CT T患者的化疗疗效患者的化疗疗效MTHFR 677 CMTHFR 677 CT TI IIIIIII级化疗反应率级化疗反应率 50.0P50.0PP0.05P0.05insignificant differe

14、ncessignificant differencesMTHFR C677TMTHFR C677T基因多态基因多态与乳腺癌新辅助化疗敏感性之间与乳腺癌新辅助化疗敏感性之间存在着一定的相关性存在着一定的相关性 MTHFR 1298A/C患者的化疗疗效患者的化疗疗效MTHFR 1298A/A患者的化疗疗效患者的化疗疗效MTHFR 1298A/CIIII级化疗反应率级化疗反应率MTHFR 1298A/AIIII级化疗反应率级化疗反应率50.0P50.0Pinsignificant differencesMTHFR A1298C基因多态基因多态与乳腺癌新辅助化疗敏感性之间与乳腺癌新辅助化疗敏感性之间相

15、关性不明显相关性不明显 有文献报道有文献报道1298基因多态对细胞内叶酸分布的影响明显低于基因多态对细胞内叶酸分布的影响明显低于677基因多态基因多态,故故 1298基因多态对化疗敏感性的影响同样低于基因多态对化疗敏感性的影响同样低于677基因多态，本研究结果亦然。基因多态，本研究结果亦然。Vander Put NM,Gab reels F,Stevens EM,et al.A second common Mutation in the methylenetetrahydrololate reductase gene:an additional risk factor for neural-tube defectsJ.Am J Hum Genet,2005,62(2):1044-1051.