膜片钳安装培训V剖析课件.ppt

1、 微电极 神经元 Patch of cell membrane with ion channelFBR_+AmplifierTechnicalThe high gain operational amplifier isconnected in the circuit so that the currentflowing through the ion channel is measuredas a voltage drop across the feedback resistor(FBR).The FBR has a resistance of 50 G allowing very small

2、 currents(10-12 A)to be measured.放大器放大器A/D转换器转换器示波器示波器刺激器刺激器防震台防震台显微镜显微镜微操微操headstage屏蔽网屏蔽网监视器监视器headstage微操作器微操作器微机微机刺激电极刺激电极MultiClamp700B电阻反馈膜片钳和高速电流钳放大器电阻反馈膜片钳和高速电流钳放大器计算机控制的微电极放大器计算机控制的微电极放大器双电极探头双电极探头MultiClampCommander液接电位调零液接电位调零电极电容补偿电极电容补偿细胞膜电容细胞膜电容膜电阻补偿膜电阻补偿电极电阻补偿电极电阻补偿Sutter公司公司 MP-225$6

3、,500电动式微操电动式微操美国美国TMC公司公司什么是膜片钳（什么是膜片钳（Patchclamp）？膜片钳膜片钳技术是一种通过技术是一种通过微电极微电极与与细胞细胞膜膜之间形成紧密接触的方法，采用之间形成紧密接触的方法，采用电电压钳压钳或或电流钳电流钳技术对生物膜上离子通技术对生物膜上离子通道的电活动进行记录的微电极技术。道的电活动进行记录的微电极技术。膜片钳技术发展简介膜片钳技术发展简介1976年德国马普生物物理化学研究所年德国马普生物物理化学研究所Neher和和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到位的同时，记录到ACh激活的单

4、通道离子电流，激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳（从而产生了膜片钳（patch clamp）技术。）技术。1980年年Sigworth等在记录电极内施加等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到的负压吸引，得到10-100G的高阻封接的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声，实现），大大降低了记录时的噪声，实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。突破。膜片钳技术发展简介膜片钳技术发展简介1981年年Hamill和和Neher等对该技术进行了改进，等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使

5、引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、的电流灵敏度、1m的空间分辨率和的空间分辨率和10s的时间分辨率。的时间分辨率。1983年年10月月 Single-Channel Recording一一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔奖。年诺贝尔奖。内尔内尔(Neher)萨克曼萨克曼(Sakmann)（1944-）（1942-）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）（德国细胞

6、生理学家）贴附式贴附式全细胞记录模式全细胞记录模式负压吸负压吸内面向外式内面向外式外面向外式外面向外式拉拉细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞拉并暴露于空气中拉并暴露于空气中四种经典记录模式四种经典记录模式(Cell-attached or On cell mode)Cell-attached configuration电压钳电压钳(Voltage Clamp)当细胞膜上的离子通道开放，产生跨膜电流；但是跨膜电流会引起膜电当细胞膜上的离子通道开放，产生跨膜电流；但是跨膜电流会引起膜电位的改变。膜电位的改变一方面会影响离子通道的开放数量；同时也会影响位的改变。膜电位的改变一方面会影响离子通道的开放数

7、量；同时也会影响离子流过通道的驱动力。这两个因素反过来又对跨膜电流产生影响。此时记离子流过通道的驱动力。这两个因素反过来又对跨膜电流产生影响。此时记录到的电流受多方面因素的影响，很难进行分析。录到的电流受多方面因素的影响，很难进行分析。电压钳电压钳是保持细胞膜电位不变，同时记录离子跨膜电流的一种方法。跨是保持细胞膜电位不变，同时记录离子跨膜电流的一种方法。跨膜电流是由膜电流是由Na+,K+,Ca2+,Cl-离子通过细胞膜上的离子通道所产生的。离子通过细胞膜上的离子通道所产生的。ImVmVcNaNa双电极电压钳原理图双电极电压钳原理图eClAg/AgClVmVceVmVcl 脑片膜片钳技术脑片膜

8、片钳技术1 1脑片撕裂法（脑片撕裂法（Slice rending methodSlice rending method）（引自：（引自：Stuart et al.,1993）（引自：（引自：Ascher P,1989）10M 10Mab（引自：（引自：The Axon Guide，1993。有改动）有改动）2 2表面清洁法表面清洁法（Surface cleaning Surface cleaning 法）法）3.3.红外微分干涉相差显红外微分干涉相差显微镜法（微镜法（IR-DICIR-DIC法法 ）4.4.盲法盲法（Blind Blind 法）法）海马脑片海马脑片CA1区锥体神经元的区锥体神经

9、元的IR-DIC影象影象海马脑片海马脑片CA1区中间神经元的区中间神经元的IR-DIC影象影象 微电极 神经元-80-70-60-50-40-30-20-10channel current(pA)-60-40-200204060 depolarization potenial(mV)I/V curve离子通道动力学性质的研究离子通道动力学性质的研究（以海马脑片全细胞记录模式为例）（以海马脑片全细胞记录模式为例）IA currents2nA20msNa+currentsIK currentsVh=-80mV 40mV-60mV2nA10ms-50mVConditioning pulsesTest

10、ing pulsesVh=-90mV2nA20ms-50mVVh=-90mV5ms2nA50ms1nAVh=-70mV70mV-50mV70mV60mV50mV细胞的胞吐与胞吞功能测定细胞的胞吐与胞吞功能测定 通过膜电容测定法可观测细胞内分泌颗粒通过膜电容测定法可观测细胞内分泌颗粒膜与胞质膜融合过程。膜电容在细胞膜不发生膜与胞质膜融合过程。膜电容在细胞膜不发生折叠时，与细胞膜表面积成正比，因而可通过折叠时，与细胞膜表面积成正比，因而可通过膜电容的变化反映胞吐与胞吞过程及其机制。膜电容的变化反映胞吐与胞吞过程及其机制。另外，膜融合产生的一过性电流也可记录到。另外，膜融合产生的一过性电流也可记录到

11、。几乎所有细胞的脂质双层膜其电容均为几乎所有细胞的脂质双层膜其电容均为1F/cm2l 与与CaCa2+2+通道邻近的递通道邻近的递质囊泡可被单一动作电质囊泡可被单一动作电位激活而释放递质；位激活而释放递质；l 而远隔部位的囊泡则而远隔部位的囊泡则需要一串动作电位的发需要一串动作电位的发放。说明若要大量的递放。说明若要大量的递质释放必须有大量的质释放必须有大量的CaCa2+2+进入。进入。CaCa2+2+通道通道递质囊泡递质囊泡细胞内钙测定与膜片钳的结合细胞内钙测定与膜片钳的结合细胞内钙测定与膜片钳的结合细胞内钙测定与膜片钳的结合 采用钙荧光测定技术和膜片钳技术同采用钙荧光测定技术和膜片钳技术同

12、时进行的手段，可实时地监测单一细胞内时进行的手段，可实时地监测单一细胞内游离钙浓度的变化与通道电现象变化的对游离钙浓度的变化与通道电现象变化的对应关系。应关系。今天的膜片钳电生理学今天的膜片钳电生理学现在现在过去过去平面膜片钳平面膜片钳 Precision Range Control HoleGeometryconsistency StabilityRmRa Rm Ra细胞定位细胞定位封接测试封接测试稳定的全稳定的全细胞记录细胞记录细胞破膜细胞破膜封接形成封接形成 Surfaces Chip Cell Solution细胞外液细胞外液Vcom细胞外液细胞外液细胞内液细胞内液Vcom 高阻封接高

13、阻封接 +稳定时间稳定时间 15 min +多功能性多功能性 +传统与传统与SealChip电生理学比较电生理学比较细胞内液细胞内液Throughput ScenariosBaseline(min.)Drug(min.)Washout(min.)SuccessRateThroughput(data pts./day)5 5 5 75%320 5 5 5 50%213 1 1 N/A 75%1152 1 1 N/A 50%768MEASREFBreatherBreatherTop channel inlet(Compound application)Bottom channel inletwit

14、h suction/pressureconnectionWasteCapillary stopRear(intracellular)flow channelFront(extracellular)flow channelMEASREFBreatherBreatherTop channel inlet(Compound application)Bottom channel inletwith suction/pressureconnectionWasteCapillary stopRear(intracellular)flow channelFront(extracellular)flow ch

15、annelThe QPlate16 or 48 patch clamp sites with intra-and extracellularflow channelsMEASREFBreatherBreatherTop channel inlet(Compound application)Bottom channel inletwith suction/pressureconnectionWasteCapillary stopRear(intracellular)flow channelFront(extracellular)flow channelMEASREFBreatherBreathe

16、rTop channel inlet(Compound application)Bottom channel inletwith suction/pressureconnectionWasteCapillary stopRear(intracellular)flow channelFront(extracellular)flow channelBottomChannelinletTopChannelinletCapillarystopTop channel-extracellularBreatherBottom channel-intracellularRecording PrincipleRecording PrincipleIntracellular(transmembrane potential)Extracellular(Action potentials)Patch-clamp Micro Electrode Array (MEA)(extracellular fieldpotential)n电压钳电压钳-Voltage Clamp 钳制电压，测量电流。钳制电压，测量电流。n电流钳电流钳-Current Clamp 钳制电流，测量电压。钳制电流，测量电压。谢谢大家！谢谢大家！